蛋白质实验

分析磷酸化位点最常见的方法是用同位素（如 32P 或 33P) 来标记蛋白，但是内源 ATP 和 GTP 的存在会导致低效标记，而且放射性标记本身不能精确显示磷酸化位点，所以需要一种替代的方法。MS 正在逐步成为一种非放射性分析磷酸化的选择。[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编 何大澄 主译

电泳胶分离的蛋白质质谱（MS) 鉴定方法是蛋白质组学的基本技术平台。事实上，由于质谱的灵敏度更高、能处理混合蛋白样品，并且具有更高的样品通量，所以它基本上取代了 Edman 降解法这一蛋白质鉴定的经典技术。目前以质谱为基础的蛋白质组策略基本上是利用有序列特异性的蛋白酶，对一维（1D) 凝胶或者二维（2D) 凝胶分离的蛋白进行凝胶原位酶解，使之成为肽段。

肽谱（或蛋白质指纹图谱）是指蛋白质利用酶解法或化学方法裂解后得到肽片段，对其进行分离、分析而获得的图谱。这项技术能提供的信息，不仅包括蛋白质的构象和蛋白质之间的相互关系（比较型肽谱），还包括蛋白质的一级结构（分析型肽谱）。[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编 何大澄 主译

蛋白质化学家测定蛋白质分子的共价结构不仅有利于深人研究蛋白质的三维结构，而且有利于我们进一步理解蛋白质分子的结构-功能的相互关系。[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编 何大澄 主译

RP-HPLC 越来越多地应用于蛋白质的分离，主要包括分析型和制备型。但如果要求纯化过的蛋白能够恢复活性并重新折叠为正确的三维结构，则不建议使用 RP-HPLC，因为许多蛋白在有机溶液中会发生不可逆变性。反相支持物（骨架）上的蛋白分析也会碰到低的回收率、畸形峰、「鬼峰（ghosting)」（即某个蛋白峰在进行下次色谱分析时虚假地再次出现）等问题。[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.

双向电泳是研究蛋白质组学的一种有效方法。与单向电泳相比，它能从复杂的蛋白质混合物中分离出更多的成分。电泳时，蛋白质迁移速度取决于它们的分子形状、大小及所带电荷多少，双向电泳利用后两项特征使蛋白质能够有效分离。[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编 何大澄 主译

从组织和细胞中提取蛋白可能是蛋白质组研究中最关键的一步，因为这一步影响了蛋白的产率、生物活性和特定目的蛋白结构的完整性。因此，我们要注意蛋白提取条件的选择。主要目标是在破坏力最小、保持蛋白结构完整性的前提下，可重复地使细胞最大程度地裂解。 [澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编 何大澄 主译

大多数用于分析蛋白质的现代电泳方法，都是建立在聚丙烯酰胺为介质的区带电泳或圆盘连续电泳的基础上（Raynond and Weintraub，1959;David，1964;Orn-stein,1964)。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel..electrophoresis，PAGE) 同时利用了分子大小和电荷差别两种属性，从而达到分离目的。 [澳] 理查德 J. 辛普森 (R

由于海洋污染可影响人类和其他自然物种，因此海洋环境的污染越来越受到人们的关注。应用蛋白质组学方法对海洋污染进行监测是评估环境污染对生态影响的一种新方法。生活在岸边和河湾的水生生物特别容易接触到各种污染物，其中包括过氧化物酶体增殖污染物（peroxisome proliferating pollutant)。但是，特殊的过氧化物酶反应和普通的生物标记反应都会受到生物或非生物因素的影响。而利用蛋白质组

环境污染物可以影响许多胞内酶活性。酶抑制因子对蛋白质组的影响可以利用双向电泳来确定。在神经内分泌细胞中，前体蛋白转化酶 1 和 2 (proprotein convertase 1 和2, P C l 和 PC2 ) 介导许多蛋白质前体水解为肽激素和神经肽。这些钙离子依赖的蛋白酶的活性可以被环境中的螯合剂和重金属离子调节。这种抑制可以导致潜在的肽能系统的病理性破坏。我们想要知道这些酶的特异性的抑制

提高酶稳定性是改造酶在高温等极端条件下行使其活性理想的设计步骤，同时也能降低酶对蛋白酶剪切的敏感性。由于这些优点，研究者已经发明了很多不同的方法和技术改造蛋白质，但到目前为止这些方法的效果很有限。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

蛋白质工程领域主要涉及关于设计新的酶活性或折叠，以及理解蛋白质正确折叠和稳定的最基本的序列决定因素。迄今，已有巨大的精力投入到设计构建多肽文库方法的研究中。最常用的方法是用来筛选具有高亲和力的特异性结合蛋白的噬菌体展示技术。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

分隔式自我复制（CSR)是蛋白酶，特别是聚合酶，定向进化的一种新方法。在 CSR 最简单形式中，它包括一个简单的环路反馈，即聚合酶只复制编码自身的基因 (自我复制）。自我复制发生在一个热稳定的油包水乳化液形成的离散、分离、没有交互的空间中。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

在这里我们介绍一种在体外将基因型和表现型相联系的新策略，用来选择功能蛋白质。这个策略里，蓖麻蛋白的 A 链在翻译时被激活，因此不需要去掉终止密码子，就能形成核糖体、信使 mRNA 和翻译出蛋白质的稳定复合物。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

本章描述了改进融合蛋白在 M13 噬菌体颗粒表面展示水平的一个方法。向 M13 衣壳锚定蛋白引入突变后，蛋白质展示水平约能增加两个数量级。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

蛋白酶生化性质的改善可以通过对该酶基因的错掺突变和 DNA 混编方法实现。混编技术可用于同一基因的一组突变体，或者对相关家族基因的片段进行新的组合，产生嵌合突变基因产物。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

利用 DNA 混编模仿自然进化过程是优化 DNA 和蛋白质性质的常用方法。这里我们介绍这类方法的一个新进展，即利用标准的聚合酶链反应（PCR)放大基因文库时与其他 4 种标准 dNTP—起掺入 dUTP 作为确定 DNA 碎裂位点的交换核苷酸。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

在设计蛋白质库进行筛选时，在能够进行筛选的物理极限内我们必须尽一切可能产生出蛋白质变体的多样性。本章的目标是将概率的语言引入蛋白质工程实验中，进而来回答一些常见的问题。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

位点特异核酸内切酶涉及核酸生物化学的许多方面。限制酶及相关酶已成为作用于 DNA 的酶的典范。通过理性蛋白设计，投入了无数的精力试图改变其特异性。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。

我们发展了用人纤连蛋白的第 10 个纤连蛋白类型Ⅲ结构域（FNfnlO)作为框架以显示用于与其他分子结合的多重表面链套的用法。我们把具有新的结合功能的 FNfnlO 变体称为“独体（孤体、单小体)”。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。