蛋白质复合体性质的研究
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简介
一般认为，在几乎所有的后生动物（metazoans), 尤其是脊椎动物中，都普遍存在选择性剪接，这就为从单基因产生多种功能性多肤提供了一'条经济的途径。根据 EST(expressedsequencedtag，表达序列标签）序列定位和对合成的mRNA (resultant mRNA) 家族进行图谱分析的结果，估计约有 35% 的人类基因能产生多种不同的剪接产物。
来源：丁香实验
操作方法
一、用于小范围分析的代谢标记 二、细胞裂解 三、用于小范围分析的免疫共沉淀 四、用抗体层析柱大规模富集 FLAG 标记的蛋白质以及与它相互作用的蛋白质 五、用于纯化的蛋白质浓缩 六、纯化和鉴定相互作用蛋白
方案2 细胞裂解液中相互作用蛋白的亲和纯化一、亲和树脂的制备 1.在固定缓冲液中，透析重组探针蛋白至少 4 h，换掉透析缓冲液，重复 2 次。 如果探针是经过 HPLC 纯化的合成肽，可以直接在固定缓冲液中进行。 要点：把蛋白质共价固定到 NHS-琼脂糖凝胶前，彻底除去所有微量的胺和含巯基的试剂（如 Tris-HCUDTT 和谷胱甘肽）；否则，这些试剂会与树脂结合的 NHS 基团反应。TCEP 是
方案3 多蛋白质复合体的非变性琼脂糖凝胶电泳实验一、非变性凝胶的制备 在非变性凝胶缓冲液中，制备水平的 0.8% 琼脂糖凝胶，规格约为 8 cm X 5.5 cm X 3 mm。 （1）将琼脂糖粉末加到有 3?4 倍体积的非变性凝胶缓冲液的锥形瓶中，称重。 （2）用倒置的烧杯盖住锥形瓶，放到微波炉中加热，直至琼脂糖熔化。 （3）再称重，如必要加水补到原来的重量。 （4）让琼脂糖在 4
方案4 BN-PAGE 蛋白质分析法一、梯度胶的制备 目前常用 4%~16.5% 的丙烯酰胺梯度胶和 4% 的丙烯酰胺浓缩胶，可以分离分子质量 1000kDa 到约 40kDa 的蛋白质复合体。但因为凝胶的顶端较易破碎，若分析的复合体蛋白分子质量小于 600kDa，可采用 6%~16.5%(或其他）的梯度胶。在制胶时，应准备好足够量的丙烯酰胺凝胶混合液，这可为重复性实验提供方便（见表 10.3)。高浓度的丙烯酰胺凝
方案5 采用交联法和质谱法对蛋白质复合体进行拓扑学分析实验一、交联反应条件的优化 不同方法得到的同种蛋白质复合体的质量与纯度不同，因此建议进行各种实验来摸索某一种蛋白质复合体的最优条件，但最好不要使用冷冻保存的蛋白质复合体（除非要进行特殊实验），因为这样常常会导致复合体的部分变性。较合理的安排是将所有的工作仔细计划后，安排好并在几天内完成，而在此期间可将蛋白质复合体于 4°c 保存。 1.（任选）若蛋白质复合体溶液的缓冲液中，含
方案6 亚秒级光交联：用水溶性金属复合体监控蛋白质-蛋白质相互作用实验一、用 Pd（Ⅱ）金属化 TMPyP 1.将 1mg (1.2umol) 的 TMPyP 溶于 1.4 ml 水中，然后加入 0.34 mg(1.9umol) 的 PdCl2, 加热至 95°C 反应 2 h。 实验提示：在金属化过程中，4 个 Q 带峰值 518nm、554nm、584nm 和 639nm，会变为 525nm 和 558nm 的两个峰，
方案7 位点特异性蛋白质-DNA 光交联法实验一、位点特异性生物素标记的 DNA 衍生片段的设计及预备 1.化学反应 2.酶反应 二、蛋白质-DNA 复合体的制备及紫外照射 1.轻轻摇动存储瓶，重悬顺磁性小磁珠。取出 3u1 的溶液转入一个硅化过的 1.5 ml 小离心管中，低速离心。 2.将管放入磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。
方案8 用 FRET 法分析体内蛋白质的相互作用实验一、实验设计 因为体内 FRET 实验的复杂性，要获得有效的能说明问题的数据，需要满足若干实验准则。详细地了解与实验有关的变化流程，不仅在实验准备阶段，而且对获取图像和数据资料的分析都是非常有用的。关于这方面的讨论见 Gordon 等（1998)。本方案中就采用了这些作者介绍的符号（见表 10.6 和「FRET 数据分析符号含义」）。关于本方案的应用见 Damelin 和 Siv
方案9 用 GFP 嵌合体监控蛋白质-蛋白质相互作用实验方法 1 荧光凝胶阻滞分析法 方法 2 荧光极性分析法
方案10 蛋白质阵列：显微镜玻片的制备一、乙醛玻片的制备 乙醛玻片是一种表面镀有乙醛功能基团的玻璃质的玻片（见图 10.7)。可以从销售商处购买到这种产品，如附属于以生产乙醛制品 SuperAldehydeSubstrates(商品名）闻名的机构 TeleChem Internation，Inc.(Sunnyvale，California)，也可以用下述的方法制备出效果更好的玻片。 1.室温条件下将洁净的纯玻
方案11 蛋白质阵列：标记蛋白并通过阵列检测来探究蛋白质-蛋白质相互作用一、蛋白标记 1.将染料溶人 250ul 水中，每 10ug 待标记蛋白中，加入 5ul 的染料溶液。蛋白质浓度不能低于 100 ug/ml。 在这样的条件下，蛋白质被标记的程度与蛋白质浓度无密切关系。虽然制造商推荐标记时的 pH 值为 9.3，但一般都在 pH 值为 7.5 的 PBS 缓冲液中进行标记。低 pH 有利于染料和蛋白质的氨基末端相连，而高 pH 值则导致染
方案12 蛋白质阵列：标记复合体并通过阵列检测来研究蛋白质-小分子相互作用一、BSA 的标记 二、小分子与 BSA 的连接 三、探针标记阵列
方案13 蛋白质阵列：阵列的探针标记方法及激酶-底物相互作用的放射性印迹检测[图片]
方案14 蛋白质阵列：用“三明治法”研究复合体溶液一、抗体阵列的制备 要了解关于蛋白质阵列制备的详细介绍，可查阅本章介绍中的「10.8.2 制作蛋白质阵列」部分。要了解梗概，参见方案11。 1.将捕获抗体溶于含 40% 甘油（体积分数）的 PBS(pH7.5) 中，使其终浓度达到 0.5 mg/ml。缓冲液中不能含有亲核性成分（如 Tris)。 抗体常常会与 BSA 竞争性地与玻片发生连接反应。可用蛋白 G 或蛋
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