材料与仪器
琼脂糖 凝胶脱色液 凝胶染色液 甘油 2 X 上样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
玻璃纸 锥形瓶 凝胶电泳装置 微量离心过滤装置 小型离心机微波炉 Ultrafree-DA 装置
步骤
一、非变性凝胶的制备
- 在非变性凝胶缓冲液中,制备水平的 0.8% 琼脂糖凝胶,规格约为 8 cm X 5.5 cm X 3 mm。
(1)将琼脂糖粉末加到有 3?4 倍体积的非变性凝胶缓冲液的锥形瓶中,称重。
(2)用倒置的烧杯盖住锥形瓶,放到微波炉中加热,直至琼脂糖熔化。
(3)再称重,如必要加水补到原来的重量。
(4)让琼脂糖在 45°C 水浴中冷却。
(5)把梳子插到凝胶灌制装置中央,倒入琼脂糖溶液。
(6)让琼脂糖凝固。
(7)把凝胶放入装有非变性凝胶缓冲液的水平电泳装置中,保证凝胶完全浸没。
小心拔出梳子。
二、蛋白质复合体的鉴定
2.用纯化的蛋白质在有利于蛋白质复合体形成的条件下,共同温育目标蛋白。
要确定细胞提取物中的蛋白质是否能与目标蛋白结合。在适于形成蛋白质复合体的条件下,取 45]ug 溶解的细胞提取物与 5ug 的纯化蛋白一起温育。
3.用 2X 上样缓冲液以 1:1(体积比)混合蛋白样品,每份 2~5ug。
蛋白样品应该包括每个单独蛋白(或使用的细胞提取物),在第②步骤中将混合物孵育。
4.加样到加样孔中(一般约 20ul 孔),室温下恒压 50V 电泳 lh。
5.在染色液中,染凝胶 20 min。在脱色液中脱色,直到能清晰地辨别蛋白条带 (图 10.16)。
6.在甘油中泡 5 min,37°C 在两层玻璃纸间干燥 24 h 以干燥凝胶。
三、蛋白质复合体的组分的分离和鉴定
7.在相邻泳道中,加 2 个相同的蛋白质复合体样品到 0.8% 琼脂糖凝胶,室温下恒压 50V 电泳 lh。
8.用锋利的刀片从凝胶上分离 2 个泳道的凝胶。
9.按步骤⑤染 2 个泳道中的一个泳道胶条。另一个泳道的胶条浸在非变性凝胶缓冲液中(缓冲液 A)。
10.鉴定含有蛋白质复合体的染色凝胶区域。从对应蛋白质复合体位置的未染色凝胶区域,切下琼脂糖条带,作为染色凝胶参照。
11.把含有复合体的未染色凝胶碎片放入 Ultrafree-DA 装置中。装置中的凝胶喷雾器能通过离心,把凝胶条转化成细小的喷雾。把过滤装置放到滤瓶中,室温或 4°下 5000 g 离心 lOmin。凝胶碎片必须通过喷雾器的口,以便将凝胶转变为细小泥浆。
凝胶颗粒通过过滤器被捕获,然后弃掉(过滤器不可重复使用)。
12.将过滤瓶中的蛋白质样品转移到微型超滤浓缩器中(所用的截点大小,由所研究的蛋白质的大小决定)。
13.14000 g 离心微量浓缩器,直至样品体积剩到 10~20ul。
蛋白质保留在微量样品储存池的膜上。
14.把微量管倒置在新的瓶中,回收浓缩蛋白质。l000 g 离心 3 min。
细节参见供应商的说明书。
15.鉴定蛋白质复合体条带各组分的大小,用 SDS-PAGE 分析浓缩的蛋白质(见第 2 章方案 1)。
凝胶中丙烯酰胺的百分比,取决于要研究的蛋白质的大小(见第 2 章表 2.2)。
或者,可用 ESI-MS 或 MALDI-MS 分析蛋白质(要求约 4Pmol)(见第 8 章)。
来源:丁香实验