蛋白质印迹（Western blot）实验方案

蛋白质印迹流程

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溶液和试剂

●裂解缓冲液

这些缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。

Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液
150 mM NaCl
1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂

RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）
150 mM NaCl
1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100
0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂

Tris-HCl 缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 7.5
蛋白酶抑制剂

●电泳、转膜、封闭缓冲液

Laemmli 2× 缓冲液/上样缓冲液
4% SDS
10% 2-巯基乙醇
20% 甘油
0.004% 溴酚蓝
0.125 M Tris-HCl

测定 pH 并调节至 pH 6.8。

电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
0.1% SDS

测定 pH，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。

转膜缓冲液（湿转）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
20% 甲醇

测定 pH，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。

对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。

转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris
39 mM 甘氨酸
20% 甲醇
0.04% SDS

封闭缓冲液
5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）

加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现「斑点」，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。

实验步骤

一、样品裂解

◇ 制备细胞培养物裂解物

1. 将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。

2. 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 10⁷ 细胞/100 mm 培养皿/150 cm² 培养瓶加入 1 ml；每 5×10⁶ 细胞/60 mm 培养皿/75 cm² 培养瓶加入 0.5 ml）。

3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。

4. 在 4 ℃ 下持续搅拌 30 分钟。

5. 在 4 ℃ 预冷的离心机中以 16000 × g 的转速离心 20 分钟。

6. 轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。

◇ 制备组织裂解物

1. 用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。

2. 将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行「速冻」。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约 5 mg 的组织，向离心管中快速加入约 300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4 ℃ 下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2 小时。

3. 4 ℃ 下在微型离心机中以 16000 × g 离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。

二、样品制备

1. 取出小部分 (50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。

2. 向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的 2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。

3. 还原和变性：在 100 ℃ 下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸 5 分钟，并进行分装。在 -20 °C 下保存裂解物。注意：分装细胞裂解物 (50 - 100 μL)，避免反复冻融循环。

4. 在 37 ℃ 下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以 16,000 × g 离心 5 分钟。

三、上样和电泳

1. 将等量的蛋白质和分子量标准上样到 SDS-PAGE 凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为 20 - 30 μg，纯化蛋白的上样量为 10 - 100 ng。

2. 在 100 V 下电泳 1 至 2 小时。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。

凝胶百分比取决于蛋白质的大小：

四、将蛋白质从凝胶转移到膜上

如下制备转移堆叠体：

膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。用甲醇「活化」PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。

所得膜可用于抗体染色。

五、抗体染色

1. 用 5% 封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4 ℃ 下封闭过夜。

2. 用适当稀释度的一抗在 5% 或 2% 封闭溶液中 4 ℃ 过夜孵育膜，或在室温下孵育 2 小时。

3. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。

4. 用推荐稀释度的标记二抗在含 5% 封闭缓冲液的 TBST 中室温孵育膜 1 小时。

5. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，然后用 TBS 冲洗。

6. 要产生信号，请遵循试剂盒制造商的建议。

7. 移除多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。

8. 利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。

相关链接

Western Blot 实验原理视频讲解，请访问：抗体加油站 。