Western Blot 蛋白样品制备——蛋白质提取
别名：跑蛋白胶，蛋白表达检测，跑胶
最新修订时间：
材料与仪器
细胞培养液、PBS、裂解液；
移液器、培养瓶、离心管、离心机；
步骤
一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：
2. 每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3. 按 1 ml 裂解液加 10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4. 每瓶细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6. 于 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷）
7. 将离心后的上清分装转移倒 0.5 min 的离心管中放于-20℃ 保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶 50 ml 的细胞有时按照实验要求只能加 100-200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的 PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到 EP 管中，这样可操作性就比较强）
二、组织中总蛋白的提取：
1. 将少量组织块置于 1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加 400 μl 单去污剂裂解液裂（含 PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4. 裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 1.5 ml 离心管中，然后在 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存。
三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1. 将培养液倒至 15 ml 离心管中，于 2500rpm 离心 5 min。
2. 弃上清，加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后 2500rpm 离心 5 min。弃上清后用 PBS 重复洗涤一次。
3. 用枪洗干上清后，加 100 μl 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起 4℃，12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存。
来源：丁香实验
