【模版】WB 实验大赛，我的方法分享

Western blotting 技术的应用非常广泛，由于可定性和定量检测目的蛋白，常用于疾病患者血清抗体的诊断、分型检测。

 

蛋白质电泳分离：

 

1．样本处理蛋白质样本首先经过离心（4 ℃，15000 r/min 离心 30 分钟）除去不溶物，再经 SDS 上样缓冲液 100 ℃ 变性 3～5 分钟，使带有强负电荷的 SDS 与带有较弱电荷的蛋白质结合，大量 SDS 可掩盖蛋白质自身的电荷量，只显示 SDS 的负电荷，在 pH8.6～pH8.8 的 Tris-甘氨酸不连续 SDS-PAGE 系统中，蛋白质的泳动与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。

 

电泳样品中总蛋白质浓度不能超过凝胶系统的装载能力，一般情况采用微型电泳系统时，每一个加样孔内的总蛋白量不能大于 5 μg，目的蛋白量在 10 ng 左右较好，蛋白量过高将出现拖尾或蛋白带融合现象。蛋白质样本如经过浓缩，须采用合适缓冲液透析除盐后上样，否则在高盐状态下电泳将出现电泳带扭曲的现象。

 

2．凝胶选择根据目的蛋白质分子大小可以选择合适的凝胶浓度，一般情况下，用于免疫印迹的 SDS-PAGE 凝胶浓度与所分离的蛋白质分子量间的关系如表 6-1 所示。为提高样本分辨率，通常采用高一级凝胶浓度的电泳系统，将获得更好的结果。

 

凝胶浓度与蛋白分子量的关系

凝胶浓度	分离蛋白质范围（MW）
8%	>50000
10%	30000～200000
12%	20000～150000
14%	10000～100000
17%	5000～100000

为使电泳后蛋白质从电泳凝胶中转移至固相支持膜上，还须考虑凝胶的浓度及厚度。凝胶的百分含量和交联度越低，转移越容易，最软的凝胶可产生最好的转移效率，但凝胶浓度过低可导致电泳带变宽、融合，降低分辨率。

 

凝胶越薄，转移效率也就越高，但过薄的凝胶易碎，导致操作困难。多数情况下采用 0.5～1 mm 厚凝胶，为提高蛋白上样量和检测敏感度，可适当增加凝胶厚度，但不宜超过 2 mm。

 

3．蛋白质标准品选择蛋白质凝胶电泳需要蛋白质标准品（molecular weight marker）指示系统，来显示电泳的分离效率、转膜效率以及样本泳动情况。SDS-PAGE 凝胶电泳如采用普通蛋白质标准品，须经蛋白质染色后才能确认上述电泳参数，故问题发现不及时，常常导致无效的重复电泳。彩色标准品（rainbow marker）可弥补这一欠缺，如表 6-4 及表 6-5 所示，该 Marker 在电泳凝胶中随蛋白质的迁移，各分子量条带逐渐分开，并显示多种色彩的条带，可直接肉眼观察泳动及分离情况，当目的分子量大小的 Marker 迁移到合适位置（距凝胶底部 1/3 处），同时其与相邻两条 Marker 达到足够分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶。蛋白质样本转膜后的转膜效率和目的蛋白质分子量，均可通过彩色标准品直接推算。

 

标准蛋白质	分子量	颜色
myosin	200000	青
phosphorylase b	97400	茶
BSA	00069	红
ovalbumin	46000	黄
carbonic anhydrane	30000	橙
trypsin inhibitor	21500	绿
lysozyme	14300	赤紫

1）安装电泳装置和玻璃板。

2）配制分离胶：按照所需浓度和体积依次混合 H20,30% 丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris（pH8.8），10%SDS，10% 过硫酸铵，最后加入 TEMED，立即快速混匀。

3）迅速在两玻璃板间隙灌入分离胶溶液，留出沉积胶所需体积和梳子齿长高度。小心地在胶上覆盖一层去离子 H20，垂直放置于室温中，约 30 分钟使胶凝聚。

4）倒出分离胶上方覆盖液体，尽量吸干。

5）配制 5% 浓缩胶，依次混合 H20,30% 丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris（pH8.8），10% SDS，10% 过硫酸铵，最后加入 TEMED，立即快速混匀。

6）在分离胶上方灌入浓缩胶，并插入梳子，避免气泡！再灌入适量浓缩胶填满梳子齿间缝隙，垂直放置于室温。

7）将蛋白样品加入等量 2 x SDS 加样缓冲液，100 ℃ 加热 3 分钟使蛋白变性。2000 r/min，常温离心 3 分钟。

8）取出浓缩胶中梳子，以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。将凝胶装置固定于电泳装置中，在上、下槽均加满 Tris-Glysine 电泳缓冲液。

9）加样 10～20 μl。

10）将电泳装置通电，电压 8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到 15V/cm，电泳至溴酚蓝到达胶底部，约 2～4 小时。

11）关闭电源，取出玻璃板，撬开玻璃板，小心取出凝胶。

 

蛋白质转膜：

 

1．半干式电印迹流程

1）Tris/甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，取出凝胶，在 Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。

2）安装印迹装置：戴手套操作，将阳极（石墨电极板）平放，蒸馏水淋洗，阳极板上放 3 张印迹缓冲液浸透的 3 mm 厚滤纸，用玻棒或滚筒轻轻碾压去除气泡！将印迹缓冲液浸透的硝酸纤维素膜放在滤纸上，再将凝胶平放在硝酸纤维素膜上，最后在凝胶上面加盖 1～3 张印迹缓冲液浸透滤纸，撵出气泡。滤纸、硝酸纤维素膜大小必须与胶大小一致，并精确对齐，否则多余的边缘互相接触会导致短路。在滤膜和凝胶剪一角或以铅笔作标记。

3）在滤纸顶部压上阴极板，连接电极，根据凝胶的面积按 0.65 mA/c㎡（微型胶常用 1～2 mA/c㎡）接通电流（如 14 mm x 14 mm 凝胶电流＜0.3 A），经 1～1.5 小时电转印，电流降至相对平稳（如 14 mm x 14 mm 凝胶电流降至 0.1 A）时，切断电源，取出膜放置在 20 mmol/L pH7.5 Tris-HCl 缓冲液内，室温漂洗 10 分钟。凝胶可进一步采用考马斯亮蓝染色，观察蛋白残留量等。半干电转印装置如图所示。

 

2．湿式电印迹流程

1）戴手套安装印迹装置：剪 2～3 张与压板大小相仿的滤纸，浸湿转移缓冲液后，放于压板阴极端的海绵衬垫上方。将 SDS-PAGE 胶放于滤纸上方，注意始终保持湿润。将 PVDF 膜剪成相似大小，浸湿后放于胶上方。将 2～3 张滤纸放于硝酸纤维素膜上方。注意上述滤纸、胶、膜、滤纸叠加过程中，用玻棒或滚筒轻轻碾压，务必去除气泡！放上浸湿的海绵衬垫，夹紧夹板。

2）安装转移装置，放于槽中，注满转移缓冲液，将整个电泳槽放在盛满碎冰的大型塑料槽中，调整电流 0.3～0.5 A，电转印 1～3 小时。

3）关闭电源，取出硝酸纤维素膜，放置在 20 mmol/L pH7.5 Tris-HCl 缓冲液内，室温漂洗 10 分钟。凝胶则可进一步采用考马斯亮蓝染色，观察蛋白残留量等。

 

特异性抗体免疫检测：

 

1．抗体的选择用于免疫印迹的抗体有多克隆及单克隆抗体。免疫检测的成功与否和抗体识别抗原表位的特异性和效率相关，凝胶电泳常导致蛋白质抗原部分变性，所选抗体应满足对电泳后抗原表位的识别，单克隆抗体只能识别特定构象抗原表位，不易识别变性后表位，因此免疫印迹常采用多克隆抗体。杂交背景与应用抗体的量相关，合适效价的抗体才能获得清晰的杂交背景和显著的目的条带。免疫印迹使用的抗体效价与间接 ELISA 法确定的抗体效价相当或高一个数量级。

 

2．封闭抗体作用之前，需对转印膜进行空白位点封闭防止免疫试剂的非特异性吸附。一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用 5% 脱脂奶粉、0.5%～2% BSA，10% 血清（马/羊）和 0.2% Tween20 等。封闭液应与检测试剂相适应，如以葡萄球菌蛋白 A（SPA）为检测试剂，就不宜用全血清封闭；其次尽可能降低非特异背景。常用 5% 脱脂奶粉和 2% BSA 封闭。封闭基本流程如下：

 

1）取漂洗的转印膜，放入含 5% 脱脂奶粉的 0.05 mol/L pH7.5 Tris-HCl 封闭液内，在摇床上室温平缓摇动 1～2 小时，或 4 ℃ 过夜。

2）以 0.05 mol/L、pH7.5 Tris-HCl-0.05% Tween20 洗液，漂洗一次，5～10 分钟。

 

注意：封闭 PVDF 膜需要比硝酸纤维素膜更高的奶粉或 BSA 浓度。封闭后的胶可冷冻长期保存，使用时用过量封闭液漂洗 10 分钟，而后检测。

 

3．抗体特异结合主要采用间接免疫法，即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上蛋白结合，再加入标记酶、放射性同位素（如 1251）等的二抗（Ab2），最后以酶底物或放射自显影显色。

 

1）将封闭后的滤膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的 1 ml Ab1（＜10 cm x 8 cm 膜），封口机封口，4 ℃ 孵育过夜或室温摇动孵育 2～4 小时。

2）洗液洗膜 3 次，每次 5～10 分钟。

3）加入标记 Ab2，室温摇动孵育 2 小时。

4）洗膜 3～6 次，每次 5～10 分钟。

4．显色/显影

 

（1）辣根过氧化物酶 ECL 显色

1）取 Western blot 用 ECL 试剂 A 和 B，用前在暗室内将 A、B 液各 1 ml 等量混合，加 2 μl 30% H₂O₂0

2）在暗室内将抗体作用后印迹膜放入显色盒，加混和显色液 2 ml，约 1 分钟，出现明显发光带。

3）将印迹膜移入暗盒内，用保鲜膜包好，上面铺一张 X 线感光胶片，大约曝光 30～60 秒，取出 X 线片，显影、定影，结果可永久保存。该步骤现已常常应用仪器直接读取发光条带，以图片形式直接反应结果，操作简便。

 

（2）辣根过氧化物酶-DAB 法

1）DAB 贮液配制：10 ml pH7.6 50 mmol/L 的 Tris-HCI 缓冲液溶解 6 mg DAB。临用前加入 5 μl 30% 的 H₂O₂0

2）加入增强金属离子的二氨基联苯胺（OPD）底物液配制：在 9 ml 的 50 mmol/L pH7.6 Tris-HCl 缓冲液中溶解 6 mg OPD，加入 1 ml 0.3% NiCl2 或 CoCl2（w/vol），形成少量沉淀，取上清用于显色。

3）显色：Ab2 作用后印迹膜放入 DAB 显色液中，室温 1～5 分钟，可见明显棕褐色显色带。以 OPD 显色呈黑色。

4）终止：用 Tris-HCl 缓冲液漂洗即可终止。立即拍照或扫描记录，经日照会褪色。

 

（3）碱性磷酸酶（AP）法

 

1）5-溴-4-氯-3 吲哚-磷酸盐四氮唑蓝（BCIP/NBT）贮液配制：NBT，10 ml 70% 的乙醇中溶解 0.5 g NBT。BCIP，10 ml 100% 二甲基甲酰胺中溶解 0.5 g BCIP。贮存液 4 ℃ 保存，稳定保存一年。

2）AP 液：0.1 mol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，0.1 mol/L Tris-HCl(pH9.5)。

3）底物显色液：取 66 μl NBT 贮液与 33 μl BCIP 加入到 10 ml AP 缓冲液中，充分混匀，临用前 1 小时内配制。

4）显色：Ab2 作用后印迹膜放入 AP-BCIP/NBT 显色液，室温下 1～5 分钟，现蓝色显色带，背景极浅时约需 30 分钟。

5）终止：用 20 mmol/L EDTA（pH8.0）的 Tris 缓冲液漂洗，终止反应。