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检测目标蛋白含量变化

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1. 准备样品

1）制冰，准备冰盒。

2）配制细胞裂解液：根据细胞数量确定所需裂解液：50 ul/六孔板一孔 。

裂解液配方：100 ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1 ul PMSF

3）按实验需要准备好细胞：去掉培养基，1×PBS洗 3 次（去掉培养基中的血清），每个孔（ 6 孔板）加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至 1.5 ml管中，置于冰上 20 min，振荡混合后，再置冰上 10 min。

4）12，000g，4℃ 离心 15 min，收集上清至另一 1.5ml 管。

5）取 2.5ul 样品加 22.5ul 三蒸水稀释，用于 BCA 法测蛋白浓度。

6）其余样品加 5×Loading Buffer（按 2.5mlBuffer/10ml 蛋白）用 95℃ 煮 10 分钟，期间振荡一次。

7）直接上样跑胶或者分装 -80°C 长期保存。

2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

1）制备分离胶（ 5ml/gel）

注：不同的分离胶配方可参见《分子克隆》p1716 表 A8-9

2）小心注入分离胶，留 2 cm左右的空间（制胶架红色边框下缘）给浓缩胶，顶层覆盖去离子水。静置约 30 分钟。

3）制备浓缩胶（2 ml/gel）

4）将浓缩胶注入分离胶上端，注意避免气泡。

5）插入梳子，待浓缩胶凝固（胶与梳子之间有明显的分界，加上分离胶的凝固时间要大于 2 h），用双蒸水将孔洗净，去除凝胶碎片，然后用滤纸吸干水。

6）将胶放入电泳槽，上下槽均加入 1 ×电泳缓冲液（反复使用不要超过 3 次）。

7）上样：marker 孔中取 5 ul prestained marker加入适量 1×上样 Buffer,使得总体积与 sample 孔一样。Sample 上样量一般为 15－25μl，先用 heating block 95℃煮 5-10 分钟，期间振荡一次，然后快速离心再上样跑胶；在没有 load sample 的孔中加入等体积的 1× 上样 Buffer。

8）电泳：开始为恒压 60-80V，当跑过浓缩胶后，将电流加大到 100-120V，电泳时间根据目标蛋白的大小及 marker 的位置确定，一般为目标蛋白跑到分离胶的三分之二的位置即可。

3. 膜转移

1) 切胶，按 Marker 指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号)，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中 15 分钟。

2) PVDF 膜做好记号后先浸入甲醇中1分钟，再连同 4 张 3mm 滤纸和海绵浸入转移缓冲液中 15 分钟。

3) 制备“夹心饼”：

依次按如下顺序：纤维垫--滤纸— PVDF 膜—凝胶—滤纸--纤维垫。

注意：每加一种物品都要对齐，确保没有气泡。

4) 转膜：转膜时间根据1）确定。

PVDF 膜一边接正极（红色），凝胶一边接负极（黑色）。

4. 膜封闭和抗体孵育

1) 转膜以后，用 10ml 的 1×TBS 室温洗膜 10 分钟。

2) 5ml 奶粉封闭液室温孵育 2h 或者 4℃ 平缓摇动过夜。由于奶粉较为难溶，因此要提前至少 1h 配置。

3) 10ml 的 TBS/T 洗膜 3 次，每次 5 分钟。

4) 加入 5ml 一抗稀释缓冲液（抗体根据说明稀释），室温 2 hrs或者 4℃ 平缓摇动过夜，回收一抗，按 5ul/ml 一抗液加入叠氮钠（可抑制细菌生长）4℃ 保存（不常用的抗体可 -20℃ 长期保存），可重复使用！

5) 10ml 的 TBS/T 洗膜 3 次，每次 5 分钟。

6) 加入二抗（一般为 1：2000 稀释），室温平缓摇动1h。

7) 10ml 的 TBS/T 洗膜 3 次，每次 5 分钟。

5. 显影，定影 （或荧光标记的二抗孵育后，直接扫描荧光）

1) 显色步骤：先铺保鲜膜，在吸水纸上再铺上保鲜膜；分别将水、显影液（颜色变深则不能用）和定影液倒入各自的盘中。2.5ml ECL-A 和 2.5ml ECL-B 混合,避光。将 ECL 混合液、膜等拿入暗房。关好门，反锁，拉回布。ECL 混合液倒入小盒中，膜用吸水纸稍微吸干放入 ECL 混合液中室温摇动 5 min（使得 ECL 均匀的铺过膜），吸水纸吸干后置于保鲜膜上，膜面朝下包好置于夹子上，剪好 X-film（注意手只能拿 X-film 的边缘）放于膜上，剪角一边为 marker (注意：取胶片时要把灯光调到最小，且不要对着灯光，应背着灯光。)，根据条带的亮度来调整曝光时间，一般可先曝光 2 min，观察条带的深度，再确定最佳的曝光时间。

2) 显影，定影: 取出 X-film 置于显影液中一定时间后(视目的条带强度与背景而定)，水洗一次再置于定影液中定影 5min 以上。

（当然，随着时代的进步，现在很多实验室很少用古老的胶片显影定影。用在最后的发光二抗孵育后，直接扫描。这类仪器很多，操作方法看不同实验室的配置）

注意不同分子量对应不同胶的浓度、电泳以及转膜时间；

转膜一定要控制好温度，是用冰水混合物降温。

1.条带偏斜咋回事？
答案：电极不平衡或者加样位置偏斜，建议调整电极和加样。

2.细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？
解答：一般地 5 * 106 就足够了。

3.同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。