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可细胞内溶蛋白和不可溶蛋白如何分离?

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dxy_s7dfn7x4

如题。想请教一下大家有没有成熟的protocol。

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4 个回答

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dxy_9njnv24q

有帮助

请问有成熟的protocol可以分享吗?我也困惑中

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huarenqiang5

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通过差速离心等方法分离细胞核或相应细胞器。在细胞破碎时加入缓冲液进行抽提,将目的蛋白溶出,同时保持合适的pH和离子强度。一般可溶蛋白用稀盐提取,脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提,不溶蛋白用稀碱处理。


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毛利小五郎的徒弟

有帮助

可溶蛋白的提取是研磨,用的缓冲液是PBS(含PIC),然后超声波(20s, 4次)。离心后的上清作为可溶蛋白的代表。pellet用加了1%SDS的PBS中作用30min,离心后的上清作为不溶蛋白的代表。

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dxy_s7dfn7x4user-title

你好 想再请教下细胞怎么弄呢?直接刮下来超声吗?

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loveliufudan

有帮助

将细胞裂解后,细胞蛋白质可以分为可溶性蛋白和不可溶性蛋白。下面是一种常用的方法,以分离细胞中的可溶性蛋白和不可溶性蛋白:

步骤:

用 PBS 等缓冲液洗涤细胞;

加入适量的 RIPA 缓冲液(含有 Triton X-100,SDS,甘氨酸等成分),裂解细胞膜并释放蛋白质;

离心裂解后的细胞悬液,分离上清液和沉淀物;

上清液中的蛋白质为可溶性蛋白,而沉淀物中的蛋白质为不可溶性蛋白。

注意事项:

蛋白裂解缓冲液的配方需根据实验需要进行优化,如选择不同种类和浓度的离子表面活性剂,或添加蛋白酶抑制剂等;

在裂解细胞时,需要注意裂解时间和裂解温度,避免过度裂解或热变性;

离心时需要注意离心速度和离心时间,以充分分离上清液和沉淀物;

不同细胞类型和不同实验目的,裂解条件和分离方法可能需要进行优化和调整。

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dxy_s7dfn7x4user-title

感谢 大致的方法我知道,但是做的时候分离的不干净(我使用laminb1作为不可溶蛋白内参,但是其在可溶蛋白部分仍有较多残留),方便请教一下更具体的protocol吗?

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