dxy_s7dfn7x4
如题。想请教一下大家有没有成熟的protocol。
dxy_9njnv24q
请问有成熟的protocol可以分享吗?我也困惑中
huarenqiang5
通过差速离心等方法分离细胞核或相应细胞器。在细胞破碎时加入缓冲液进行抽提,将目的蛋白溶出,同时保持合适的pH和离子强度。一般可溶蛋白用稀盐提取,脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提,不溶蛋白用稀碱处理。
毛利小五郎的徒弟
可溶蛋白的提取是研磨,用的缓冲液是PBS(含PIC),然后超声波(20s, 4次)。离心后的上清作为可溶蛋白的代表。pellet用加了1%SDS的PBS中作用30min,离心后的上清作为不溶蛋白的代表。
dxy_s7dfn7x4
你好 想再请教下细胞怎么弄呢?直接刮下来超声吗?
loveliufudan
将细胞裂解后,细胞蛋白质可以分为可溶性蛋白和不可溶性蛋白。下面是一种常用的方法,以分离细胞中的可溶性蛋白和不可溶性蛋白:
步骤:
用 PBS 等缓冲液洗涤细胞;
加入适量的 RIPA 缓冲液(含有 Triton X-100,SDS,甘氨酸等成分),裂解细胞膜并释放蛋白质;
离心裂解后的细胞悬液,分离上清液和沉淀物;
上清液中的蛋白质为可溶性蛋白,而沉淀物中的蛋白质为不可溶性蛋白。
注意事项:
蛋白裂解缓冲液的配方需根据实验需要进行优化,如选择不同种类和浓度的离子表面活性剂,或添加蛋白酶抑制剂等;
在裂解细胞时,需要注意裂解时间和裂解温度,避免过度裂解或热变性;
离心时需要注意离心速度和离心时间,以充分分离上清液和沉淀物;
不同细胞类型和不同实验目的,裂解条件和分离方法可能需要进行优化和调整。
dxy_s7dfn7x4
感谢 大致的方法我知道,但是做的时候分离的不干净(我使用laminb1作为不可溶蛋白内参,但是其在可溶蛋白部分仍有较多残留),方便请教一下更具体的protocol吗?