丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

柱式法 Minute TM 脂肪组织和细胞的总蛋白

相关实验:脂肪组织和细胞的总蛋白提取

最新修订时间:

材料与仪器

【材料】新鲜或冷冻脂肪组织; 【试剂】试剂盒;蛋白提取粉;缓冲液 A、B、C;

步骤

1. 将缓冲液 A,离心管柱和接收管套管放置于冰上预冷。 2. 秤取 50-80 mg 新鲜或冷冻脂肪组织,把它放在几层纸巾上,用拇指和食指挤压,从组织中去除一部分油。用镊子将组织放入试剂盒提供的 1.5 ml 离心管中,秤取 100 mg 蛋白提取粉加入样品中。加入 50ul 缓冲液 A。 3. 用研磨棒扭转研磨组织样品 1-2 分钟成浆状。再加入 200-300ul 缓冲液 A,继续研磨样品 30 秒钟。如果起始组织量较小(20-40 mg)需要加入 100-150ul 缓冲液 A。 4. 盖上盖子,2000rpm 离心 1 分钟。将上清液转移到放置在接收管里的离心管柱中(研磨棒可以重复使用,用酒精擦拭清洁,空气干燥)。 5. 在-20℃,开盖孵育 15-20 分钟。(请确保冰箱温度在-20℃ 附近,否则参照下面的常见问题) 6. 孵育后立刻在 2000rpm,开盖离心 1-2 分钟。弃去离心管柱,所得为脂肪组织中的总蛋白。提取出的蛋白中含有少量不溶物为非水溶性细胞组分。可以将其稀释后直接用于 ELISA 检测水溶性蛋白。也可以用缓冲液 B 或 C 重悬溶解非水溶性蛋白用于下游应用: A. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 缓冲液 B 成为变性蛋白溶液(用于 SDS-PAGE,Western 和其他应用)或者 B. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 缓冲液 C 成为非变性蛋白溶液(用于 IP,ELISA 和其他应用)或者 C. 用 2X 的 2D 胶样品缓冲液溶解用于 2D 分析。

注意事项

注意:缓冲液 A 中含有可能会感染质谱分析的组分。如果提取的蛋白用于质谱分析,在提取前需透析缓冲液,或者用 TCA 法沉淀蛋白。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序