柱式法 Minute TM 脂肪组织和细胞的总蛋白

【材料】新鲜或冷冻脂肪组织； 【试剂】试剂盒；蛋白提取粉；缓冲液 A、B、C；

1. 将缓冲液 A，离心管柱和接收管套管放置于冰上预冷。 2. 秤取 50-80 mg 新鲜或冷冻脂肪组织，把它放在几层纸巾上，用拇指和食指挤压，从组织中去除一部分油。用镊子将组织放入试剂盒提供的 1.5 ml 离心管中，秤取 100 mg 蛋白提取粉加入样品中。加入 50ul 缓冲液 A。 3. 用研磨棒扭转研磨组织样品 1-2 分钟成浆状。再加入 200-300ul 缓冲液 A，继续研磨样品 30 秒钟。如果起始组织量较小（20-40 mg）需要加入 100-150ul 缓冲液 A。 4. 盖上盖子，2000rpm 离心 1 分钟。将上清液转移到放置在接收管里的离心管柱中（研磨棒可以重复使用，用酒精擦拭清洁，空气干燥）。 5. 在-20℃，开盖孵育 15-20 分钟。（请确保冰箱温度在-20℃ 附近，否则参照下面的常见问题） 6. 孵育后立刻在 2000rpm，开盖离心 1-2 分钟。弃去离心管柱，所得为脂肪组织中的总蛋白。提取出的蛋白中含有少量不溶物为非水溶性细胞组分。可以将其稀释后直接用于 ELISA 检测水溶性蛋白。也可以用缓冲液 B 或 C 重悬溶解非水溶性蛋白用于下游应用： A. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 缓冲液 B 成为变性蛋白溶液（用于 SDS-PAGE，Western 和其他应用）或者 B. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 缓冲液 C 成为非变性蛋白溶液（用于 IP，ELISA 和其他应用）或者 C. 用 2X 的 2D 胶样品缓冲液溶解用于 2D 分析。

注意：缓冲液 A 中含有可能会感染质谱分析的组分。如果提取的蛋白用于质谱分析，在提取前需透析缓冲液，或者用 TCA 法沉淀蛋白。