简介
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot，通过特异性抗体与凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，分析其着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。
Western Blot 鉴定外泌体蛋白可以检测膜蛋白（如 CD63、CD81、CD82、HLA、integrin 等），检测膜结合蛋白或外泌体游离蛋白（前者如 ALIX、TSG101，后者如 HSP70、ACT 等）。
用途
通过 WB 检测外泌体样本中蛋白的表达情况。
材料与仪器
材料：外泌体样本、BCA 蛋白定量试剂盒、5x SDS protein loading buffer、不同浓度 SDS page 胶、电泳液、转膜液、PVDF膜、skim milk、TBST、抗体、发光液等；
设备耗材：EP 管、摇床、电泳仪、转膜仪、离心机、96 孔板、移液器、枪头、ECL 扫膜仪、酶标仪等
步骤
1、蛋白浓度测定
1.1 取标准品和稀释待测样品 25μL 加入到 96 孔板中；
1.2 取 200μL 的 BCA 工作液于 96 孔板中，37℃ 孵育 30min；
1.3 多功能酶标仪测定 A562 的吸光度；
1.4 根据标准品测值绘制标准曲线，通过标曲计算出待测样品的蛋白浓度。
2、SDS-PAGE 凝胶制备
2.1 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用 1% 的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2.2 将装好的玻璃电泳板倾斜成 45～60° 角。
2.3 当凝胶准备好倒入时，添加 TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。
2.4 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成 10° 角，可减少液体泄漏的机会。
2.5 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入 0.1x TBE 缓冲液。
2.6 小心取出梳子，加样。
3、实验流程
3.1 将样品原液稀释至所需的上样量，然后按照样本稀释液：loading buffer 为 4:1 的比例加入 loading buffer。
3.2 充分混合后稍离心，95℃ 加热 5min 后放于冰盒上待冷却后4℃。
3.3 固定凝胶板到电泳装置内，外槽加入适量的 1x SDS 电泳缓冲液，内槽加入1× SDS 电泳缓冲液至刚好淹没凝胶加样孔。
3.4 拔出凝胶板中的梳子，待电泳也充满加样孔后， 将冰盒中的样品 12000g 离心 5min 后上样。80V 电压下电泳 30min 至溴酚蓝染料浓缩胶进入分离胶后将电压调制 120V 继续电泳 60min。
3.5 取 PVDF 膜在甲醇中活化 5min，然后将膜与滤纸在缓冲液中平衡 15min 后与 SDS-PAGE 电泳完成后取出的凝胶夹层放入加有转移液的实验盘内。
3.6 取出夹层中的凝胶，去除浓缩胶后的分离胶用 1× 转膜缓冲液漂洗一次。
3.7 以海绵→三层滤纸→分离胶+ PVDF 膜←三层滤纸←海绵的方式在转膜槽中 180mA 转膜 2h。注意除去制样中产生的气泡，同时转膜过程中会产热，可将转膜槽外部置于冰上转膜。
3.8 将转膜后的 PVDF 膜置于 5% 脱脂奶粉的 TBST 的孵育盒中，室温脱色摇床上摇动封闭 1h。
3.9 封闭完成后，将膜的蛋白面朝上置放于适当浓度的一抗稀释液中，4℃ 脱色摇床上摇动孵育过夜，室温下 TBST 摇动洗 3 次，每次 10min。
3.10 对应二抗室温孵育 1~2h 后 TBST 摇动洗 3 次，每次 10min。
3.11 将膜置放于成像仪中加入 ECL 发光液进行化学发光反应，拍照。
注意事项
1、定量尽量原液测量尝试，浓度相对会降低，体液样本除外。
2、浓度不宜过高，可能条带会过载变形；浓度过低时，最大浓度制样即可。
常见问题
未检测到预期条带：
1、使用特殊抗体稀释液，增强目的条带；或者更换发光液、以及成像方法等等可以改善。
2、可能该该样本确实不含有该蛋白，建议增加合适的阳性对照说明。
条带大小与理论不符：
1、许多蛋白由于可能发生糖基化等修饰，如：CD63 可能经常在55kD 检测到条带。
2、更换合适的抗体，特别是血液类样本，可以减少杂带等。
【参考文献】
RUAN Z, TAKAMATSU-YUKAWA K, WANG Y, et al. Functional genome-wide short hairpin RNA library screening identifies key molecules for extracellular vesicle secretion from microglia [J]. Cell Rep, 2022, 39(6): 110791.
MA S, MANGALA L S, HU W, et al. CD63-mediated cloaking of VEGF in small extracellular vesicles contributes to anti-VEGF therapy resistance [J]. Cell Rep, 2021, 36(7): 109549.
来源：丁香实验
