方案2 细胞裂解液中相互作用蛋白的亲和纯化

一、亲和树脂的制备

1.在固定缓冲液中，透析重组探针蛋白至少 4 h，换掉透析缓冲液，重复 2 次。

如果探针是经过 HPLC 纯化的合成肽，可以直接在固定缓冲液中进行。

要点：把蛋白质共价固定到 NHS-琼脂糖凝胶前，彻底除去所有微量的胺和含巯基的试剂（如 Tris-HCUDTT 和谷胱甘肽）；否则，这些试剂会与树脂结合的 NHS 基团反应。TCEP 是一种非亲核性还原剂，可以保持蛋白质的还原性，不会干扰后面的固定化学反应。

2.测量在 280nm 处的吸收值，确定透析蛋白质的浓度。

实验提示：用透析缓冲液作为分光光度计的空白对照（blank)。蛋白质的摩尔消光系数由方程 nW(5690)+nY(1280) 决定。其中 nW 和 nY 分别是融合蛋白中 Trp 和 Tyr 残基的数量。

3.室温下，用 200fxl 洗涤过的 NHS 活化的琼脂糖与 6 mg 透析的蛋白质温育 3 h，并在旋转混合器中温和振荡。

同时，根据步骤③~⑤，用探针树脂制备对照树脂。如果探针蛋白已经是表达的融合蛋白，那么对照树脂应由固定到 NHS 琼脂糖上的融合标签（如 GST) 组成。否贝 U，对照树脂只是经乙醇胺阻断的 NHS-琼脂糖。

4.加 0.1 倍体积的 lmol/L 乙醇胺（pH8.0)，阻断任何未反应的 NHS 基团。室温下继续在旋转混合器中温和振荡 3 h 或 4°C 过夜。

5.把树脂转移到一次性的 IOml 层析柱中，用 50 ml 固定液洗涤树脂。

树脂可于 4°C 下，在含有 0.02%(体积分数）叠氮化钠的固定缓冲液中保存。树脂的保质期取决于固定蛋白的稳定性。如果已知重组探针蛋白会快速降解，那么树脂应尽快使用。使用前，立即用裂解缓冲液洗涤亲和树脂（见第 9 章）。

二、相互作用蛋白质的纯化

6.收集 IXlO9 个培养细胞，用 5 ml 冰冷的裂解缓冲液冰上裂解细胞 30 min。

对于悬浮培养的细胞，要得到上述要求的细胞数量应该是比较容易的。对于贴壁细胞，初始实验中可能要达到的细胞数量是 IXlO8 个。

7.把细胞裂解液转移到微量离心管中，4°C 下最高速离心 15 min。

8.（可选择）把上清加到 150ul 预先用裂解缓冲液洗过的对照树脂中。在旋转混合器中 4°C 温育混合物 2 h，短暂离心，然后除去上清。

实验提示：这个预清除步骤用于减少与探针蛋白树脂非特异性结合的蛋白。开始尝试此方法时，最好不用进行这个步骤，但如果观察到背景蛋白污染的水平很髙，可以采用这个步骤。?

9.各取 50ul 树脂，加到不同的微量离心管中，用裂解缓冲液洗涤树脂几次，. 每次洗涤后离心沉淀树脂。最后重悬树脂到最初的同样浓度，每份 4u1，分装到新的管中。

10.把细胞裂解液分成两份，一半加到 40ul 探针蛋白树脂中，另一半加到 4ul 对照树脂中。在旋转混合器中 4°C 温育 2 h。

这些树脂适用于大多数需要，但要根据树脂上所载探针蛋白的密度进行调整。小蛋白或肽可较高密度地固定，这样可使用较少的树脂。相反，如果探针蛋白分子量较大，可能要用较多的树脂，所用树脂体积越大，背景蛋白污染的程度就越高。

11.短暂离心混合物，除去上清，用 2 ml 冰冷的裂解缓冲液洗涤树脂，短暂离心，除去上清。重复洗涤步骤 3 次以上。

实验提示：洗涤的程度仅做参考。如必要，可根据对照树脂中捕获的背景蛋白的水平来增加或降低洗涤的程度。

12.加 30ul 2XSDS-PAGE 凝胶上样缓冲液到每个树脂样品洗脱下来的结合蛋白中，95°C 加热 4 min。

13.在 4%~20% SDS-PAGE 梯度凝胶中电泳样品（见第 2 章，方案 1)。

14.考马斯亮蓝染色，显现蛋白条带（见第 2 章，方案 2 或方案 3)。

如果考马斯染色看不到条带，重复实验，采用银染。注意，标准的银染方法（见第 4 章方案 11 和第 7 章方案 11) 不适用于原位消化和质谱分析。尽管适用于质谱的银染程序灵敏度低一些，但可考虑采用。见第 2 章方案 7。

15.通过比较两块凝胶上的蛋白质总览，即由固定探针蛋白树脂和对照树脂捕获的裂解物中蛋白质。用干净的解剖刀切下探针蛋白树脂捕获的所有特异性条带，做后续的原位消化和质谱分析。