从酵母中小规模自然亲和纯化溶解膜蛋白
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一、材料与方法
1. EDTA(无蛋白酶抑制剂)(Roche)
2. 酸冲洗过的425-600玻璃珠(Sigma)
3. 洋地黄皂苷(digitonin)(EMDChemicals)
4. 蛋白酶抑制剂(DMSO,亮肽素,胃蛋白酶抑制剂)(Sigma)
5. BECKMAN1.5 ml 离心管(BECKMAN)
6. 抗FlagM2亲和胶(Sigma)
7. 3XFLAG多肽(Sigma)
二、仪器设备
1. BECKMAN离心机、TLA-55转子
三、实验步骤
1. 细胞裂解
(1)酵母摇至25OD,集菌。4℃,用1 ml H2O或PBS缓冲液洗涤细胞。若需要,可在-80℃保存样品。
(2)用150 ul 预冷好的免疫沉淀缓冲液重悬细胞,缓冲液(无DTT)中加入0.1%digitonin和蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂。加入玻璃珠没于液面下。在冷藏室,涡旋振荡10分钟。Digitonin是强刺激性非离子去污剂,可以完整提取膜蛋白。
(3)加入850 ul 免疫沉淀缓冲液(包含1.16%Digitonin和蛋白酶抑制剂,无DTT),定容至1 ml。此时Digitonin终浓度为1%。4℃,翻转摇床孵育30分钟,此过程中膜蛋白可溶于缓冲液中。转移液体至新的BECKMAN离心管中。
(4)100 000 g 离心10分钟,去除为裂解的细胞、细胞核、细胞膜。膜蛋白已从膜上分离,溶于上清中。离心(用TLA-55转子,47 246 rpm),吸取上清。保存80 μl 上清,作为input对照。
2. 带有FLAG标签的蛋白的免疫沉淀反应
(1)每个反应使用50 μl 胶悬浮液。(~25 μl 填充胶)。若使用亲和柱则使用量更小(~10 μl 填充胶,可以结合>1 μg FLAG-标签蛋白)。
(2)悬起抗-FLAGM2亲和柱。悬浮液与填充胶的比例应为2:1。转移50 μl 悬浮缓冲液及亲和柱至新的试管中。转移应使用移液管,并剪去其尖头。
(3)400 g 离心1分钟。静置1~2分钟。用移液管去除上清。
(4)用1 ml 含有0.1%digitonin的免疫沉淀缓冲液漂洗吸附柱,重复4次。洗涤过程中尽量保证漂洗液去除干净,并且没有丢失吸附柱。这是为了确保在蛋白结合柱子前,甘油已经完全去除。如果免疫沉淀样品较多,可以同时漂洗吸附柱。在漂洗后,根据样品数量分配吸附柱。每次漂洗,应使用大于吸附柱体积20倍的漂洗液。(如25 μ l吸附柱,>500 μl 漂洗液)
(5)向漂洗过的吸附柱中加入800 μl 细胞裂解产物。可以用免疫沉淀缓冲液将总体积定容至1 ml。细胞裂解产物的体积取决于细胞中表达的带有FLAG标签的蛋白的量。加入1 ml 裂解缓冲液作为负对照。
(6)搅动样品,在翻转摇床上轻柔孵育2.5小时。
(7)400× g 离心1分钟。用移液管去除上清。保存80 μl 上清作为未结合对照。
(8)用1 ml 免疫沉淀缓冲液漂洗吸附柱,重复4次。
3. 洗脱带有FLAG标签的蛋白
用3×FLAG多肽洗脱。此方法洗脱效率极高
(1)准备3×FLAG洗脱缓冲液。加入30 μl 漂洗缓冲液(含0.25%digitonin和2 μg/μl 3×FLAG多肽)
(2)向有吸附柱的试管中加入30 μl 3×FLAG洗脱缓冲液。
(3)4℃,摇床轻柔孵育30分钟。
(4)400~1 000× g 离心1分钟。将上清转移至新试管中。注意不要吸入吸附柱。