植物质膜蛋白的提取和溶解
丁香园
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1. 前言
植物质膜（PM ) 调控着细胞与环境之间的信息和物质交流。这种界面的位置赋予 PM 蛋白在细胞活动中的关键作用，如信号转导、代谢、离子运输和内吞，以及对病原体的反应和细胞壁融合，这些都是具体的植物职能。细胞膜物理化学性质的不同是它们分离的基础。质膜可以根据三大程序纯化。
( 1 ) PM 与其他膜之间大小和密度的不同是用于分离的一个特点。该步骤需要对微粒部分进行连续或非连续的密度梯度离心 [1] 。
( 2 ) 自由流电泳程序利用细胞膜的电荷来分离细胞膜 [2] 。PM 比其他膜带更多的负电荷并且因此可以有效地跟其他细胞膜分离。但这种做法需要一个特殊的自由流电泳仪装置。
( 3 ) 用两相分离法分离 PM 部分依赖于膜囊泡之间不同起源的表面特性。这一技术潜在的原则是众多的水溶高分子质量的聚合物超过一定浓度不相互混合，而是形成分离相，每个分离相包含 85% 以上的水。这种含聚合物的分离相很适合做生物分析材料。根据不同的表面特性加入的膜在水性聚合物相之间被分离这项技术最初由 Laesson 等 [ 3 ]描述，现在由于它实现了 PM 蛋白的高产和没有其他内膜污染，已被广泛使用在对植物群落的科学研究，此外，它是一个简单的方案，不需要特定的设备。
膜蛋白可分为两组：那些跨越脂质双层的蛋白被定义为内在或整合蛋白质，其他的为膜联蛋白。联合过程是由翻译后的修饰，如通过嫁接一个不饱和脂肪酸或蛋白质互作播定糖脂来介导的。这暗示了蛋白质与 PM 关联的动力学的发生。在富含质膜的部分，无论是外在的功能与 PM 相关的蛋白质或胞质内的污染物 [4] ，很大比例（60%~80% ) 的蛋白质是可溶的。因此，由于整合蛋白质在 PM 部分的比例低，当直接溶解 PM 部分时，即使用如十二烷基硫酸钠（SDS) 这种最高效率的去垢剂，可能在复性整合蛋白质方面效率也是低的。
以使用去污剂 [ 5 ] 、有机溶剂 [ 5~7 ] 或碱性处理膜 [ 5，8，9 ] 为基础的方法被用来分离镶嵌蛋白。其中，作为一种容易的且有效率的方法，碱性提取已得到了广泛普及，在不影响组分完整的情况下，有选择性地从膜上分离外在的蛋白质 [ 10 ] 。在本章中，描述了一个基于用碱性-尿素处理 PM 的方案，此方案能够复性疏水性非常强的蛋白质，如水通道蛋白 [ 11~13 ] 。
越来越多的数据显示，膜蛋白的功能和亚细胞定位是受翻译后修饰调控的。双向凝胶电泳构建了一个通用的能够分离修饰后蛋白质的方法。因此，由于等电点 pI 或是表观分子质量的不同，糖基化、酰基化或脱酰基化后的蛋白质点会成列出现 [ 14，15 ]；磷酸化和 α-乙酰化分别把蛋白质的 pI 转向酸性 pH 和碱性 pH，但不改变表观分子质量。更为普遍的是，任何带电残基的共价修饰，都会修改蛋白质的净电荷，反过来使蛋白的 pI 发生变化。由于它们的高疏水性，造成了双向凝胶电泳分析整合蛋白质的局限性，需要使用特殊的溶解步骤 [18 ] ( 见第 12 章），并且表达丰度低。本章描述了从模式植物拟南芥的根和叶悬浮细胞中纯化 PM 的方案，得到能用于蛋白质组学分析的可溶性 PM 蛋白。水通道蛋白是含有 6 个跨膜 α-螺旋 [ 19~22] ，26~35 kDa 的疏水性质膜镶嵌蛋白（PIP ) ，被用来作为评估相关的提取及溶解方案的对照蛋白质。
植物质膜（PM ) 调控着细胞与环境之间的信息和物质交流。这种界面的位置赋予 PM 蛋白在细胞活动中的关键作用，如信号转导、代谢、离子运输和内吞，以及对病原体的反应和细胞壁融合，这些都是具体的植物职能。细胞膜物理化学性质的不同是它们分离的基础。质膜可以根据三大程序纯化。
( 1 ) PM 与其他膜之间大小和密度的不同是用于分离的一个特点。该步骤需要对微粒部分进行连续或非连续的密度梯度离心 [1] 。
( 2 ) 自由流电泳程序利用细胞膜的电荷来分离细胞膜 [2] 。PM 比其他膜带更多的负电荷并且因此可以有效地跟其他细胞膜分离。但这种做法需要一个特殊的自由流电泳仪装置。
( 3 ) 用两相分离法分离 PM 部分依赖于膜囊泡之间不同起源的表面特性。这一技术潜在的原则是众多的水溶高分子质量的聚合物超过一定浓度不相互混合，而是形成分离相，每个分离相包含 85% 以上的水。这种含聚合物的分离相很适合做生物分析材料。根据不同的表面特性加入的膜在水性聚合物相之间被分离这项技术最初由 Laesson 等 [ 3 ]描述，现在由于它实现了 PM 蛋白的高产和没有其他内膜污染，已被广泛使用在对植物群落的科学研究，此外，它是一个简单的方案，不需要特定的设备。
膜蛋白可分为两组：那些跨越脂质双层的蛋白被定义为内在或整合蛋白质，其他的为膜联蛋白。联合过程是由翻译后的修饰，如通过嫁接一个不饱和脂肪酸或蛋白质互作播定糖脂来介导的。这暗示了蛋白质与 PM 关联的动力学的发生。在富含质膜的部分，无论是外在的功能与 PM 相关的蛋白质或胞质内的污染物 [4] ，很大比例（60%~80% ) 的蛋白质是可溶的。因此，由于整合蛋白质在 PM 部分的比例低，当直接溶解 PM 部分时，即使用如十二烷基硫酸钠（SDS) 这种最高效率的去垢剂，可能在复性整合蛋白质方面效率也是低的。
以使用去污剂 [ 5 ] 、有机溶剂 [ 5~7 ] 或碱性处理膜 [ 5，8，9 ] 为基础的方法被用来分离镶嵌蛋白。其中，作为一种容易的且有效率的方法，碱性提取已得到了广泛普及，在不影响组分完整的情况下，有选择性地从膜上分离外在的蛋白质 [ 10 ] 。在本章中，描述了一个基于用碱性-尿素处理 PM 的方案，此方案能够复性疏水性非常强的蛋白质，如水通道蛋白 [ 11~13 ] 。
越来越多的数据显示，膜蛋白的功能和亚细胞定位是受翻译后修饰调控的。双向凝胶电泳构建了一个通用的能够分离修饰后蛋白质的方法。因此，由于等电点 pI 或是表观分子质量的不同，糖基化、酰基化或脱酰基化后的蛋白质点会成列出现 [ 14，15 ]；磷酸化和 α-乙酰化分别把蛋白质的 pI 转向酸性 pH 和碱性 pH，但不改变表观分子质量。更为普遍的是，任何带电残基的共价修饰，都会修改蛋白质的净电荷，反过来使蛋白的 pI 发生变化。由于它们的高疏水性，造成了双向凝胶电泳分析整合蛋白质的局限性，需要使用特殊的溶解步骤 [18 ] ( 见第 12 章），并且表达丰度低。本章描述了从模式植物拟南芥的根和叶悬浮细胞中纯化 PM 的方案，得到能用于蛋白质组学分析的可溶性 PM 蛋白。水通道蛋白是含有 6 个跨膜 α-螺旋 [ 19~22] ，26~35 kDa 的疏水性质膜镶嵌蛋白（PIP ) ，被用来作为评估相关的提取及溶解方案的对照蛋白质。
