材料与仪器
拟南芥属植物
超纯水 EGTA 贮存液 NaF 贮存液 洗涤缓冲液（WBSC ) 微粒缓冲液
华林式搅拌器 细胞破碎器
超纯水 EGTA 贮存液 NaF 贮存液 洗涤缓冲液（WBSC ) 微粒缓冲液
华林式搅拌器 细胞破碎器
步骤
3.1 质膜的分离
1. 分离微粒体部分
从机械破坏的叶、根组织或悬浮细胞中分离 PM 部分首先需要分离含有 PM 的微粒体膜部分。然后经过两相分离从微粒体部分分离质膜。所有的步骤在 4°C 进行。
1 ) 拟南芥的叶片和根
( 1 ) 迅速收集叶片和根，放在置于冰上的湿润的纸上，然后用冰冷的蒸馏水简单漂洗。称量材料的鲜重。匀浆液与组织的比例是 2：1 [ 介质（ml) /鲜重（g ) ]。全部的匀浆液加入组织，在华林搅拌器中低速匀浆 10s，然后高速离心 4 次每次 10s。
( 2 ) 所得匀浆用一个尼龙布（直径 100 μm ) 过滤，以去除所有的细胞壁碎片。
( 3 ) 过滤后的匀浆在最高 26000 g 离心 25 min，使叶绿体和线粒体沉淀。
( 4 ) 去除沉淀，用两张连续的滤纸（直径分别为 63 μm 和 34 μm) 过滤上清液。
( 5 ) 在最高 84000 g 下离心 25 min，可从上清液中得到微粒体沉淀。所得颗粒沉淀用总体积 9 ml 的微粒缓冲液/20~40 g 鲜重（表 11-2) 重悬。
2 ) 拟南芥悬浮细胞
( 1 ) 通过一个孔隙度 2 的玻璃纤维。悬浮细胞用冷洗涤缓冲液（1：1，WBSC/悬浮细胞）（见 11. 2. 3 节 2 ) 清洗。
( 2 ) 称量材料的鲜重。
( 3 ) 悬浮细胞在匀浆液中孵育 10 min {2.5：1，[ 介质（ml) /鲜重（g )]}。
( 4 ) 细胞在华林搅拌器中预先低速匀浆 10s，然后在细胞破碎器中彻底破碎，使细胞在高压气体压力下研碎。通过施加的高压力（0.54 kbar) 使细胞通过一个直径 180 μm 的压力隧道。从高压向低压转移期间细胞获得高速。通过空穴作用，发射的细胞含爆裂。
( 5 ) 然后细胞匀浆在最高 10000 g 离心 10 min。
( 6 ) 上清液用直径 100 μm 的尼龙布过滤。
( 7 ) 在最高 50000 g 离心 35 min，从上清液中得到微粒体沉淀。沉淀重新用总体积 9 ml 的微粒缓冲液/20~40 g 鲜重（见表 11-2) 重悬。
2. 两相分离法分离质膜
( 1 ) 分离质膜与从拟南芥悬浮细胞、叶、根中分离 PM 用的是相同的方案。两相分离法受温度变化影响，所以最好始终在低温房间操作。
( 2 ) 27 g 相系统混合 9 g 悬浮微粒（最多相当于 40 g 鲜重）。过度上样会影响相分离系统的准确性。
( 3 ) 用力摇晃管子 15~20 次。确保管中物质混合均匀，葡聚糖要与微粒体悬浮液充分混合。
( 4 ) 该系统通过离心 2000 g，10 min 分离成两个部分。PM 衍生的囊泡优先分布进入 PEG-上层相（upl) ，而来自其他膜的膜囊泡则分布进入下层相（lowl，图 11-1)。
( 5 ) 为从上层相中纯化出 PM，该相被重新进行两相分离，得到下层相（low2，图 11-1)。
( 6 ) 通过 9 g 微粒体缓冲液与 27 g 两相分离体系混合得到上、下新层相。
( 7 ) 在匀浆以 2000 g 离心 10 min 之后，得到两个新的层相 up2 和 low2。分别将 upl 和 low2 混合，lowl 和 up2 混合。
( 8 ) 经过其他的匀浆和离心步骤，得到了分出的相 up3、low3、up4、low4 ( 图 11-1 )。
( 9 ) 上层相 up3 被收集。
( 10 ) 上层相 up4 与下层相 low3 混合在一起。
( 11 ) 经过匀浆/离心，洗涤后的 up4 被收集。
( 12 ) 在 60 ml 洗涤缓冲液中稀释上层相 up3 和 up4，（表 11-4)，然后在最高 85000 g 进行沉淀离心 35 min。针对叶片和根系悬浮细胞时，在最高 176000 g 粒化 30 min 的情况下。
( 13 ) 沉淀的 PM 蛋白质在加入了 10 μmol/L 的亮抑蛋白酶肽和 5 mmol/L DTT 的洗涤缓冲液中重悬，在液氮中速冻，可长期放于 -80°C。
( 14 ) 每 100 g 鲜重蛋白质产量为 1.5~2.5 mg ( 见注释 3 ) 。
即使仔细地运用两相体系，彻底纯化也几乎是不可能的；因此，有必要通过其他膜和可溶性蛋白估计 PM 部分的相对污染（见注释 4 和注释 5) 。
3.2 富集疏水性蛋白质
在碱处理中，对 PM 膜的尿素-氢氧化钠处理使得疏水性蛋白水通道蛋白得到更好的复性（见注释 6 和 图 11-2)。
( 1 ) PM 蛋白（0.5 mg) 在 15 ml 的缓冲液 A 中（见表 11- 5 ) 于冰上 5 min，然后在最高 100000 g 条件下离心 10 min。
( 2 ) 弃去上清液，得到的沉淀在 20 mmol/L NaOH 中重悬并且在最高 100000 g 离心 10 min。
( 3 ) 沉淀的蛋白质用缓冲液 B ( 表 11 - 6 ) 洗净，然后在最高 100000 g 下离心 10 min。
( 4 ) 最后得到的沉淀在 PM 保存缓冲液（表 11 - 4 ) 中重悬进行蛋白质实验。（见注释 3)。
( 5 ) PM 蛋白部分由样本缓冲液 SB2X（表 11- 7 ) 稀释两倍后进行 SDS-PAGE 电泳（图 11-3 和见注释 7) 。
3.3 双向凝胶电泳分离蛋白质
1. 蛋白质的溶解
( 1 ) PM 蛋白（120 μg；全部的 PM 或经尿素氢氧化钠处理的 PM ) 在最高 100000 g 富集 15 min。
( 2 ) 富集沉淀在 350 μl 的双向电泳溶液（表 11- 8 ) 中重悬，不断摇动 1 h。
( 3 ) 在 10000 g 离心 10 min 后，小心收集上清液，用双向电泳溶液调整至 350 μl (表 11-8)。
2. 2D 凝胶电泳
( 1 ) 用商业化的固定 pH 梯度胶条（线性或非线性 pH 梯度 3~10，18 cm 长；Amersham Pharmacia Biotech) 进行等电聚焦（IEF) 实验，使用 IPGphor 设备（Amersham Pharmacia Biotech)。
( 2 ) 胶条在 350 μl 的样品蛋白质上样后重新水化，被动水化 4 h，然后在恒定电压 ( 50V ) 条件下主动水化 7h。
( 3 ) 胶条在如下条件下聚焦：从 0~300V，1 min；300V 3 h；300~3500V，1h，3500V，80 kVh。
( 4 ) IEF 之后，胶条继续在含有 2% DTT 和 2.5% 巯基乙醇的平衡液里室温下平衡 ( 根据 Chevallet 等，注释 26) 。
( 5 ) 二向电泳（SDS-PAGE ) 在均匀的 11% T 凝胶（Protean I I，Bio-Rad ) 中进行。
( 6 ) 胶条用低熔点的琼脂糖 [28] 密封在电泳凝胶的上方。
( 7 ) 电泳：20 mA，1 h，然后在 40 mA，4~5 h。
( 8 ) 为了方便其后的质谱分析，凝胶分别用银染或考马斯 G-250 进行染色（图 11-4 和 图 11-5，见注释 8) 。
1. 分离微粒体部分
从机械破坏的叶、根组织或悬浮细胞中分离 PM 部分首先需要分离含有 PM 的微粒体膜部分。然后经过两相分离从微粒体部分分离质膜。所有的步骤在 4°C 进行。
1 ) 拟南芥的叶片和根
( 1 ) 迅速收集叶片和根，放在置于冰上的湿润的纸上，然后用冰冷的蒸馏水简单漂洗。称量材料的鲜重。匀浆液与组织的比例是 2：1 [ 介质（ml) /鲜重（g ) ]。全部的匀浆液加入组织，在华林搅拌器中低速匀浆 10s，然后高速离心 4 次每次 10s。
( 2 ) 所得匀浆用一个尼龙布（直径 100 μm ) 过滤，以去除所有的细胞壁碎片。
( 3 ) 过滤后的匀浆在最高 26000 g 离心 25 min，使叶绿体和线粒体沉淀。
( 4 ) 去除沉淀，用两张连续的滤纸（直径分别为 63 μm 和 34 μm) 过滤上清液。
( 5 ) 在最高 84000 g 下离心 25 min，可从上清液中得到微粒体沉淀。所得颗粒沉淀用总体积 9 ml 的微粒缓冲液/20~40 g 鲜重（表 11-2) 重悬。
2 ) 拟南芥悬浮细胞
( 1 ) 通过一个孔隙度 2 的玻璃纤维。悬浮细胞用冷洗涤缓冲液（1：1，WBSC/悬浮细胞）（见 11. 2. 3 节 2 ) 清洗。
( 2 ) 称量材料的鲜重。
( 3 ) 悬浮细胞在匀浆液中孵育 10 min {2.5：1，[ 介质（ml) /鲜重（g )]}。
( 4 ) 细胞在华林搅拌器中预先低速匀浆 10s，然后在细胞破碎器中彻底破碎，使细胞在高压气体压力下研碎。通过施加的高压力（0.54 kbar) 使细胞通过一个直径 180 μm 的压力隧道。从高压向低压转移期间细胞获得高速。通过空穴作用，发射的细胞含爆裂。
( 5 ) 然后细胞匀浆在最高 10000 g 离心 10 min。
( 6 ) 上清液用直径 100 μm 的尼龙布过滤。
( 7 ) 在最高 50000 g 离心 35 min，从上清液中得到微粒体沉淀。沉淀重新用总体积 9 ml 的微粒缓冲液/20~40 g 鲜重（见表 11-2) 重悬。
2. 两相分离法分离质膜
( 1 ) 分离质膜与从拟南芥悬浮细胞、叶、根中分离 PM 用的是相同的方案。两相分离法受温度变化影响，所以最好始终在低温房间操作。
( 2 ) 27 g 相系统混合 9 g 悬浮微粒（最多相当于 40 g 鲜重）。过度上样会影响相分离系统的准确性。
( 3 ) 用力摇晃管子 15~20 次。确保管中物质混合均匀，葡聚糖要与微粒体悬浮液充分混合。
( 4 ) 该系统通过离心 2000 g，10 min 分离成两个部分。PM 衍生的囊泡优先分布进入 PEG-上层相（upl) ，而来自其他膜的膜囊泡则分布进入下层相（lowl，图 11-1)。
( 5 ) 为从上层相中纯化出 PM，该相被重新进行两相分离，得到下层相（low2，图 11-1)。
( 6 ) 通过 9 g 微粒体缓冲液与 27 g 两相分离体系混合得到上、下新层相。
( 7 ) 在匀浆以 2000 g 离心 10 min 之后，得到两个新的层相 up2 和 low2。分别将 upl 和 low2 混合，lowl 和 up2 混合。
( 8 ) 经过其他的匀浆和离心步骤，得到了分出的相 up3、low3、up4、low4 ( 图 11-1 )。
( 9 ) 上层相 up3 被收集。
( 10 ) 上层相 up4 与下层相 low3 混合在一起。
( 11 ) 经过匀浆/离心，洗涤后的 up4 被收集。
( 12 ) 在 60 ml 洗涤缓冲液中稀释上层相 up3 和 up4，（表 11-4)，然后在最高 85000 g 进行沉淀离心 35 min。针对叶片和根系悬浮细胞时，在最高 176000 g 粒化 30 min 的情况下。
( 13 ) 沉淀的 PM 蛋白质在加入了 10 μmol/L 的亮抑蛋白酶肽和 5 mmol/L DTT 的洗涤缓冲液中重悬，在液氮中速冻，可长期放于 -80°C。
( 14 ) 每 100 g 鲜重蛋白质产量为 1.5~2.5 mg ( 见注释 3 ) 。
即使仔细地运用两相体系，彻底纯化也几乎是不可能的；因此，有必要通过其他膜和可溶性蛋白估计 PM 部分的相对污染（见注释 4 和注释 5) 。
3.2 富集疏水性蛋白质
在碱处理中，对 PM 膜的尿素-氢氧化钠处理使得疏水性蛋白水通道蛋白得到更好的复性（见注释 6 和 图 11-2)。
( 1 ) PM 蛋白（0.5 mg) 在 15 ml 的缓冲液 A 中（见表 11- 5 ) 于冰上 5 min，然后在最高 100000 g 条件下离心 10 min。
( 2 ) 弃去上清液，得到的沉淀在 20 mmol/L NaOH 中重悬并且在最高 100000 g 离心 10 min。
( 3 ) 沉淀的蛋白质用缓冲液 B ( 表 11 - 6 ) 洗净，然后在最高 100000 g 下离心 10 min。
( 4 ) 最后得到的沉淀在 PM 保存缓冲液（表 11 - 4 ) 中重悬进行蛋白质实验。（见注释 3)。
( 5 ) PM 蛋白部分由样本缓冲液 SB2X（表 11- 7 ) 稀释两倍后进行 SDS-PAGE 电泳（图 11-3 和见注释 7) 。
3.3 双向凝胶电泳分离蛋白质
1. 蛋白质的溶解
( 1 ) PM 蛋白（120 μg；全部的 PM 或经尿素氢氧化钠处理的 PM ) 在最高 100000 g 富集 15 min。
( 2 ) 富集沉淀在 350 μl 的双向电泳溶液（表 11- 8 ) 中重悬，不断摇动 1 h。
( 3 ) 在 10000 g 离心 10 min 后，小心收集上清液，用双向电泳溶液调整至 350 μl (表 11-8)。
2. 2D 凝胶电泳
( 1 ) 用商业化的固定 pH 梯度胶条（线性或非线性 pH 梯度 3~10，18 cm 长；Amersham Pharmacia Biotech) 进行等电聚焦（IEF) 实验，使用 IPGphor 设备（Amersham Pharmacia Biotech)。
( 2 ) 胶条在 350 μl 的样品蛋白质上样后重新水化，被动水化 4 h，然后在恒定电压 ( 50V ) 条件下主动水化 7h。
( 3 ) 胶条在如下条件下聚焦：从 0~300V，1 min；300V 3 h；300~3500V，1h，3500V，80 kVh。
( 4 ) IEF 之后，胶条继续在含有 2% DTT 和 2.5% 巯基乙醇的平衡液里室温下平衡 ( 根据 Chevallet 等，注释 26) 。
( 5 ) 二向电泳（SDS-PAGE ) 在均匀的 11% T 凝胶（Protean I I，Bio-Rad ) 中进行。
( 6 ) 胶条用低熔点的琼脂糖 [28] 密封在电泳凝胶的上方。
( 7 ) 电泳：20 mA，1 h，然后在 40 mA，4~5 h。
( 8 ) 为了方便其后的质谱分析，凝胶分别用银染或考马斯 G-250 进行染色（图 11-4 和 图 11-5，见注释 8) 。
来源：丁香实验
