植物DNA的提取实验

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实验内容
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析和琼脂 糖凝胶电泳.

目的要求
掌握CTAB法从植物 叶片提取DNA的原理和方法.

实验原理
1,原理

核酸是生物有机体中的重要成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在.核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类,在真核细胞中,前者主要存在于细胞核 中,后者主要存在于细胞质及核仁里.在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来.

在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很
小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀.

反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液,就能将蛋白等杂质较彻底地除去,得到较纯的DNA制品.为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA,可用RNA酶处理.生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖,在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去.

在DNA提取 ,制备的过程中,核酸极不稳定,许多因素可破坏其完整结构:①化学因素,核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定,pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸过碱.②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性.又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免.

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