植物DNA的提取与纯化

一、实验目的：
了解植物DNA提取和纯化的一般方法。
二、实验原理 ：
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA。提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
SDS法:SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间  常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法:CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。这里我们使用SDS法。
DNA纯化：蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP。
三、实验材料与 仪器 ：
植物叶子，DNA提取缓冲液，24:1/氯仿:戊醇，其它 试剂 ：液氮、TE缓冲液、无水乙醇、70%乙醇，研钵，水浴锅，离心机，移液器等。
四、实验步骤：
1.取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；
2.在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite, 混匀并调pH至8.0；
3.在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀；
4.冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇15分钟左右；
5.室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精-20 ℃放置1h或过夜；
6.挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次；
7.吹干DNA，加入适量TE在65℃溶解，完全溶解后离心去除杂质；
8.加入RNase（10mg/mL）,室温处理0.5-1h,除去RNA，4℃或-20℃贮存。
9.如需纯化DNA，再加入适量TE，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇，-20 ℃放置1h或过夜；
10.吹干沉淀后，加入适量TE， 65℃溶解， 4℃或-20℃贮存。