质粒DNA的提取与纯化

一、实验目的与原理

质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。

提取质粒的基本步骤分为三步：

①细菌的培养和质粒的扩增

②细菌菌体的裂解

③质粒DNA的纯化

本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。

二、材料与试剂

1、材料：大肠杆菌

2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪

3、试剂：

Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
10 mM EDTA(pH8.0)
50 mM葡萄糖
高压灭菌，4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高压灭菌，4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂

三、操作步骤

1、细菌繁殖

LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜

2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液

3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃

加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min

4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min

5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min

6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃

7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min

8、离心10 min，12000 rpm, 4℃

9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中

10、加入40 ul，3 M NaAc

11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀

12、离心10 min，12000 rpm, 4℃

13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14、电泳检测提取DNA的质量