表达与纯化的平行方法实验

一、引言

平行蛋白质纯化主要是一个逻辑学的挑战。有许多纯化方法可以用于蛋白质分离。一些方法从本质上比其他方法更经得起平行方法的检验(Gmslund etal., 2008a; Kimetal.，2004; Lesley et aL，2002b)。 多数平行纯化策略使用纯化标签, 这样可以使简单的标准化亲和纯化的方法变得更容易。虽然在这个方案中描述了一个用蛋白酶 切 割 H i s 标签的方法，其他标签甚至无标签的方法都可以发展成为平行过程并适合于许多应用。本文并非包罗万象，只是意在介绍目前作者实验室使用的方法, 作为一个讨论来阐明平行方法的主要方面。迄今为止该方法已经应用于上千种蛋白质, 并且提供了适合多种应用的蛋白质。

二、基于最终用途的策略

成功的蛋白质表达和纯化通常需要对多种表达构建体(expression construct)进行评价 。许多重复截短型突变体和一些同源的蛋白质需要确定一个合适的构建体(construct)以进行重组表达。构建和鉴定这些突变体需要具有平行表达筛选和蛋白质鉴定的能力，这也是成功的重要障碍。这里「成功」的界定在很大程度上取决于该蛋白质的最终用途(end-use)。作为一种简单的抗原应用时，表达足够量的蛋白质( 甚 至 以聚集的形式)用于免疫才足以宣称「成功」。更多的时候, 生物化学研究或蛋白质结构应用的要求不仅是获得纯化的蛋白质，更要求该蛋白质折叠正确，并含有合适的辅助因子或翻译后修饰，而且主要是天然的均质状态。在定义任何纯化策略或评价过程之前，必须充分理解最终用途,并设计步骤以达到所需的参数。结晶学是对最终用途要求最严格的应用之一。通常 ，适合结晶的蛋白质也足以满足生物化学、免疫学和其他功能学研究的应用。这些蛋白质应该正确折叠(不仅可溶)、非聚合、均质、较少的非结构区域(unstructured region)，并且表达水平足够应用于多个结晶实验。在大多数情况下，筛选多个目标蛋白质衍生物以及与目标蛋白质相关的蛋白质才能达到这些标准（图 41.1)。这些纯化的蛋白质需要进行平行处理，并对它们的性质进行平行鉴定。

对感兴趣的蛋白质进行任何实验前者卩应进行生物信息学的评估。随着大量的基因组信息的获得，对那些功能信息很少甚至几乎没有的蛋白质进行比对，可以为蛋白质表达的设计指导提供有用的思路。软件的变化非常迅速，因此这里并不提供详细的分析方法，而是提供一些可作为通用方法的指导a 因此，首要的任务是识别相关蛋白质，并进行比对以鉴定其保守区域。这些区域通常构成核心结构域，需要在表达构建体中予以保留，并且可以用于鉴定结构域的边界。基本局部比对搜寻工具(B L A ST)(A ltsch u l e t a l . ，1990)是对 相 关 序 列 进 行 简 单 检 索 的 最 常 用 的 工 具 。 NCBI (h ttp ://blast.ncbi.nlm .nih.gov/B la s tc g i? CM D= W eb& P A G E _T Y P E = B lastH om e) 提供了这一基本工具的多种版本 ，可查询大多数的基因组序列，并可使用。可以开发隐马尔可夫模型（hidden M arkovm odel,H M M )用于更加复杂的搜索，不 过 简 单 的 PSI-B L A S T 的查询通常足以找出最有用的最密切相关的序列。

大多数蛋白质已经进行过比对，并归类为家族。 Pfam (h ttp ://pfam.sanger.ac.uk/)即为此类比对数据库，可提供相关蛋白质的大量有用的比较研究信息，包括结构域边界和序列保守性。 U n iP ro t(h ttp :/,’w w w.uniprot.org/)(C onsortium , 2008)同样是一个有用的汇总数据来源，包括对大多数蛋白质二级结构域的预测。配体对于蛋白质的稳定化处理和活性检测也是非常有用的工具。配 体 预 测 可 以 从 注 释 显 见 ，但 是 一 些 数 据 库 ，如KEGGCh ttp ：//W W W .genome.jp/kegg/) (K anehisa et al. , 2008)和 BioCyc (h ttp ://w w w.biocyc.o r g )(K arp et al.，2005)可以提供额夕卜的配体建议。最后，简单的文献检索往往可以发现之前别人表达过的相关蛋白质，用以指导表达。虽然看似是一个简单的任务 ，然而急于获得在实验室已有系统中可以表达的构建体往往导致不去检索以往的文献而草率行事。还有许多其他有用且方便获得的生物信息学工具。基本建议是，了解你要
表达的蛋白质以及与其密切相关的蛋白质信息，并且利用这些信息来设计实验。

把感兴趣的蛋白质的有用信息收集在一起后就可以设计其表达构建体了。最成功的方法不仅评价全长的开放阅读框（open reading frame,O R F ), 而且平行构建并检测该O R F 的多个截短型突变体。定 义 N 端 和 C 端的边界是至关重要的。我们已经观察到许多实例，蛋白质末端的一个或几个氨基酸的不同将完全改变蛋白质行为。即使了解序列保守性信息，也应该尝试多个N 端 和 C 端 。

(1) 利 用 B L A S T 查询相关蛋白质的现有基因组序列，并进行序列比对。像 P fa m 等工具可以对这些査询提供方便的讨论，并且提供预审查比对(prevetted alignm ent)和结构域边界。合并文献检索中获得的信息。

(2) 识 别 N 端 和 C 端保守序列位置作为初始截短边界。在某些情况下，内部结构域边界可能更好。例如, 激酶研究者通常研究催化结构域本身。

(3) 从这些初始边界开始，选 择 5〜1 0 个 额 外 的 N 端 和 C 端 。最终表达构建体的集合应该是这些末端的矩阵组合。我们已经发现增加大约4 个氨基酸可以提供一个有用的末端范围，且不会增加筛选的构建体数。对全长和空载体对照进行筛选的合适的筛选数量级是一个 I O X 9 矩阵组合(90个构建体）。

(4) 以最终用途为指标检查对边界的选择，确定保留了关键区域。

三、用于构建表达构建体的平行克隆策略

有许多不同的方法可用于克隆和突变。每个实验室根据过去的经验都有其各自的喜好 。然而，构建大量独特的表达克隆是艰巨的任务。一 些克隆方法本质上更适合平行方法过程。一种常见方法是利用lambda In t/X is/fflF 在 att位点的重组将 Q R F移人不同的受体载体中（Hatley e t a l .， 2000)。 Gateway ® 是这种方法的商业化形式，广 泛应用于构建带有不同标签的表达载体, 但通常会表达由重组位点编码的额外氨基酸。 T 载体(Harrison et al. , 1994)、拓扑异构酶联载体（Shuman, 1994)和 cre-Iox 重组载 体 (Liu eta l.， W 98)同样适合平行克隆项目，但不是特别灵活，并且构建一个定制载体通常需要大量工作。我们的实验室使用以下两种方法，即 不 依 赖 于 连 接 反 应 克 隆（ligation-independent-cloning，LIC) (Aslanidis and de Jong, 1990)和聚合酶不完全引物延伸（polymerase incomplete primer extension，PIPE) (Klock et a l.， 2008)已经构建了上千种表达克隆 。两种方法都为将ORF克隆入表达载体中提供了足够的灵活性，可使用常规引物，快捷且只需要最少量的试剂。这里将描述 PIPE方 法 ，该方法同样也提供构建截短型突变体的方便步骤。

P I P E 方法是基于P C R 扩增产生未完全延伸产物的混合物，这些产物含有不同程度未配对 的 5’端 。这 与 L I C 类似，利用有校对功能的聚合酶移除3’端核苷酸。 P C R 产物的未 配 对 5’端来源于合成的扩增引物。因此，寡核苷酸的设计决定了 5’端的悬臂，并可用于克隆策略。只 需 制 备 5’端 大 约 1 5 个互补碱基的 P C R 产物插人片段和载体，将二者退火后转化，即可得到稳定的表达质粒(图41. 2 ) 。



 

复苏。再 取 100 uL或 4 0 uL复苏的感受态细胞，加人带有玻璃珠的选择性琼脂平板的各个孔中。手持平板，轻轻晃动，使玻璃珠均匀移动于整个培养孔的表面。 翻转平板, 将玻璃珠倒在盖子上，并弃之。 平 板 在 37°C中倒置培养12〜16 h 。

可以用传统方法筛选分离的克隆，如 分 离 划 线 法 。另外, 大量的克隆可通过鉴定PCR(diagnostic PCR， dPCR)或 SYBR-PCR 来筛选。

(1)取 200 ul含有合适抗生素的LB液体培养基到平底9 6 孔板的孔中。无菌操作，每个转化分别挑选并转移1〜4 个分离的克隆到96孔板的单一孔中。在 37℃ 、250 r / m i n孵育 该 9 6 孔 板 3〜 12 h。

(2) 每份培养物中取3 uL样 品 到 9 6 孔 P C R 板中。将其余的培养物放回摇床继续培养令其继续生长，以备未来甘油保种。

⑶ P C R 板上每个含有菌体的孔中加人47 P C R 试剂混合液、一条基因特异的引物和一条载体特异的引物。引 物 应 该 设 计 成 只 有 载 体 包 含 目 标 片 段 时 才 能 被 扩 增 。D N A 片段在适合引物的条件下扩增3 0 个循环。

⑷ 加 50 uL 10 mmol/L ED TA 到 平 底 9 6 孔板中。转 移 5 uL各 种 P C R 产物到每个孔中，并加入 150 uL SYBR 缓冲液[40 ul 10 000 X SYBR Green I Dye(Sigma)稀释到20ml 50mmol/L Tris -HCl)中，制 成 20x溶液]。

(5) 用未扩增样品作为阴性对照，利用荧光读板机测定每个样品的荧光值。激发波长 :485 n m ; 发射波长:525 n m 。

(6) S Y B R 结果的判定基于相对范围内阳性孔比阴性孔或对照孔的荧光值高4 倍以上 。 d P C R 阳性反应可通过凝胶分析或直接测序步骤来确认。

四、小规模表达筛选以鉴定合适的构建体

对克隆的小规模的评价是克隆选择过程中的一个整体部分。获得高产量重组蛋白，并作为裂解物的可溶组分，常常是遇到的第一个主要的难题。然而 ，很多时候，这个单一的标准主导了决定过程，会造成虚假的成功感并导致后续阶段有更多的工作。筛选方法如 融 合 报 告 基 因（Lesley et al. ， 2002a ; W a W o et al.， 1999)和 克 隆 印 迹（MartinezMolina et al. ， 2008)提供了筛选上千种蛋白质衍生物的手段。与分子伴侣融合可以提高溶解度(Kapust and W a u g h ,1999)，这是另一种已经用于为可溶性而界定合适的构建体边界的策略。在许多情况下，这些可溶性蛋白质是部分折叠的蛋白质的聚集物与异质混
合 物 (图 41. 3A 、B )。这将成为纯化过程中的问题，往往造成产品的低产量和不稳定，并且给获得特异的高活性蛋白质或蛋白质的结晶带来问题。蛋白质的部分水解可以用来确定稳定边界。获得的稳定片段通过质谱鉴定，可被用于界定后续表达构建体。加入目标蛋白质的配体也起到令其稳定的效果（图 4 1 . 3 0 。配体可以通过筛选方法来鉴定，如Therm ofluor(Pantolianoetal.， 2001)，或通过注释和实验预测。在可能的程度，额外的蛋白质分析应该在早期阶段进行，其分析结果被列为大规模研究而选择表达构建体的决策的考虑因素。考虑到这些告诫，表达筛选应该足以允许这些测试的规模实施。

小规模的表达筛选采用深孔微孔板作为一种便捷方式，用以繁殖足够的菌体以评估蛋白质表达。菌体的最大生长需要优化表达条件。尤其培养物的溶解氧是生长的限制因素 ，因此短柄平板摇床（short-throw plate shaker)和透气性平板盖子可提高最终产量 。在每一步都必须注意将体积损失控制在最小，因为即便是很小的体积变化也会对最终产量产生非常大的影响。

(1)准备所需的克隆，在 含 有 8 5 0 ul 含 2 % 甘油和所需抗生素的T B 的 9 6 孔深孔板中过夜培养。

(8)用 300uL的平衡缓冲液润湿9 6 孔过滤板, 保证足够的真空以在过滤网下留下一薄层液体。加人上一步中已经结合蛋白质的树脂，并使上清液流过过滤板。在每孔中加人 700 uL 的冲洗缓冲液[50 m mol/L H E PE S(pH 8.0)、 300 m mol/L NaCU 40 m mol/L咪唑、1 0 % 甘油 、 I m m ol/L T C E P]，并使之流出。200 离心过滤板 I m in, 以去除剩余的冲洗缓冲液。将一个收集盘放在过滤板下方。加入150 mL 的洗脱缓冲液[50 m m ol/L H E PE S (p H 8. 0)、 300 m m ol/L 咪唑、1 0 % 甘油、 I m m ol/L T C E P]并孵育 5 m in。将过滤 板 在 200 g离心5 m in, 收集纯化的蛋白质。在这步中避免树脂过度干燥是非常重要的 ，因为这可能会导致树脂床干裂，造成清洗不充分，以及洗脱出树脂本身。

五、 用于选择的蛋白质的分析测试

鉴定蛋白质制备物的质量与均质性的方法有很多。确定一种特定的表达构建体或纯化方法是否合适，需要借助于由这些方法获得的数据。许多这类测试对蛋白质的需求量很大。然而，在某些情况下，缩减的方法可以应用于小规模筛选以提供有用的蛋白质性质参数。表 41. 1 中列出的一些分析方法可以应用于小量的蛋白质。

可 溶 性 蛋 白 质 的 产 生 是 成 功 纯 化 的 第 一 步 。在 许 多 情 况 下 , 改 变 生 长 条 件 ，如 降 低 表达 温 度 或 改 变 表 达 构 建 体 (如 与 诸 如 麦 芽 糖 结 合 蛋 白 这 样 的 高 度 可 溶 性 分 子 伴 侣 融 合 )将极 大 地 提 高 目 标 蛋 白 质 产 物 的 可 溶 性 。然 而 ，相 对 于 其 正 确 折 叠 产 物 ，这 些 蛋 白 质 经 常 形成 活 性 和 稳 定 性 降 低 的 可 溶 性 聚 集 体 。最 好 尽 早 识 别 和 避 免 这 些 问 题 。分 析 型 大 小 排 阻色 谱 (analytical size exclusion chromatography,A N S E C )是 一 种 方 便 的 、预 测 性 的 方 法 ，可 以 应 用 于 平 行 测 试 模 式 。通 过 减 小 柱 的 尺 寸 并 且 增 加 流 速 , 筛 选 方 法 可 以 达 到 的 通 量为 每 样 品 13〜 18 m i n 。将 这 种 方 法 与 H P L C 自 动 进 样 器 结 合 ，小 规 模 方 法 获 得 的 一 满 板
的 ％ 个 纯 化 的 蛋 白 质 可 以 在 一 天 之 内 完 成 筛 选 。本 文 提 供 的 色 谱 方 法 用 AgilentH P llO O 运 行 I 3.3 m in，该 设 备 带 有 具 制 冷 功 能 的 384孔 制 式 的 自 动 进 样 器 。另 一 个 分辨 率 稍 高 的 方 法 运 行 18 m in，并 且 对 分 子 质 量 很 大 的 样 品 会 更 轻 柔 。

(1) 用 20 m m o l / L Tris ( p H 7 . 5 ) 、200 m m o l / L N a C l 、 0. 25 m m o V L T C E P 、3 m m o l / L N a N 3 平 衡 合 适 的 大 小 排 阻 柱（size exclusion column, Shodex 8 X 300 m mProtein K W -803 column with 6 X 50 m m Protein K W - G guard column) 。流速为 I,0 〜I.5 m L /m i n 。 需 要 约 30 m i n 。

(2) 柱 中 平 衡 适 当 ，A 280nm基 线 稳 定 后 ，注 射 上 样 样 品 蛋 白 质 5〜 15 uL(视 浓 度 而 定 ) 。合 适 的 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 和 空 白 缓 冲 液 ，应 该 在 样 品 之 前 以 及 大 约 5 0 个 样 品 (体 积 )之后 上 样 。

(3) 图 41.3 A 、B 给 出 了 一 个 典 型 结 果 的 比 较 图 。虽 然 快 流 速 和 相 对 短 的 柱 子 无 法实 现 高 分 辨 率 的 蛋 白 质 大 小 测 定 ，但 在 图 中 很 容 易 看 到 高 分 子 质 量 聚 合 物 的 相 对 比 例 及蛋 白 质 的 单 体 状 态 。通 常 ，相 比 那 些 被 蛋 白 质 聚 集 体 污 染 的 蛋 白 质 ，即 使 最 初 的 纯 化 产 量较 小 ，也 更 加 倾 向 于 采 用 一 致 的 单 体 状 态 的 蛋 白 质 。

为 了 在 众 多 构 建 体 中 选 出 正 确 的 那 个 ，需 要 了 解 蛋 白 质 的 最 终 用 途 。例 如 , 蛋 白 质 结晶 要 求 蛋 白 质 是 单 分 散 、均 质 的 ，并 且 不 含 非 结 构 区 域 。虽 然 许 多 构 建 体 可 能 提 供 足 够 的可 溶 性 蛋 白 质 进 人 结 晶 实 验 , 通 过 S D S- P A G E 、A N S E C 、配 体 结 合 和 蛋 白 酶 稳 定 性 的 评 估可 以 有 效 地 将 选 择 范 围 缩 小 至 倾 向 的 候 选 物 。在 小 规 模 筛 选 阶 段 获 得 的 信 息 越 多 ，选 择的 决 定 就 会 做 得 越 好 。

六、大规模平行表达

大 规 模 蛋 白 质 的 平 行 表 达 纯 化 通 常 需 要 一 些 特 殊 的 设 备 。表 达 纯 化 的 规 模 应 该 适 合蛋 白 质 的 最 终 用 途 。 I L 细 菌 表 达 物 通 常 足 以 满 足 大 多 数 实 验 室 的 需 求 。大 多 数 情 况下 ，简 单 利 用 多 个 I L 的 摇 瓶 就 足 够 了 , 但 是 在 放 大 1 0 倍 或 1 0 0 倍 时 这 种 方 法 就 难 以 应用 。气 升 式 发 酵 罐（airlift fermentor， http://w w w .gnfsystems.c o m )提 供 了 表 达 96 种不 同 蛋 白 质 的 方 便 手 段 ，在 规 模 上 与 常 规 的 I L 摇 瓶 相 当（图 41.4)(Lesle y ，2001)。细菌培 养 物 的（)D « „„值 可 达 25〜 30, 可 为 后 续 的 处 理 产 生 几 克 菌 体 。

裂 解 与 纯 化 多 个 培 养 物 是 大 规 模 的 平 行 处 理 中 的 最 大 逻 辑 学 挑 战 。定 制 自 动 操 作 系统 对 此 有 促 进 作 用 ，但 更 多 是 通 过 简 化 裂 解 与 纯 化方 法 来 实 现 。这 里 给 出 的 方 法 用 于 纯化 带 有 H i s 标 签 的 蛋 白 质 ，其 含 有 T E V 切 割 位 点 方 便 去 除 标 签 。我 们 发 现 这 个 方 法 即便 不 使 用 自 动 化 也 很 可 靠 ，且 容 易 平 行 放 大 至 许 多 蛋 白 质 。我 们 实 验 室 每 年 用 这 种 方 法处 理 超 过 3 0 0 0 种 蛋 白 质 。

（1） 直 接 取 自 发 酵 的 含 有 表 达 蛋 白 质 的 菌 体 在 室 温 下 ，每 毫 升 加 人 0.25 m g 卵 清 溶菌 酶 孵 育 30 m i n ，离 心 收 集 沉 淀 ，将 沉 淀 冻 存 直 至 使 用 。将 约 3 g 沉 淀 在 80 m L 裂 解 缓 冲液 [50 m m o l / L H E P E S ( p H 8.0)、50 m m o l / L N a C l 、10 m m o l / L imidazole、 I m m o l / LTris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride(T C E P ) ] 中 解 冻 以 用 于 纯 化 。每 份 菌 体沉 淀 依 如 下 方 法 裂 解 。

(2) 使用勻浆仪( O m n i International)于 35 000 r/m i n (最大设置)将菌体沉淀与裂解缓冲液均质勻浆，共作用约80 s。每个循环由探针接近匀浆底部超声6 s ，随后探针在接近勻浆表面超声3 s 的过程组成。两个过程都可以重悬并有效地裂解菌体。如果观察到裂解不充分，则可令裂解物通过微射流机(microfluidizer，Microfluidics公司）或法兰西压榨器(French press)。

(3) 裂解产物于32 000 g 离 心 30 m i n 。澄清的裂解液准备用于亲和纯化。

在平行纯化中，传统的纯化方法会是一个明显的瓶颈。已有描述将 H P L C 用于多个样品处理的仪器和步骤(M c M u l l a n e t a l . ， 2005)。然而, 对于大多数应用，优化亲和纯化可以提供足够的纯度及必要的通量。我们发现两步锡纯化与蛋白质水解去除纯化标签相结合是非常好的纯化方法，并且可以平行用于在不同规模的上百个样品中。已证明该方法提供的蛋白质纯品适合结晶实验和酶学筛选研究。我们的载体包含一个T E V 蛋白酶裂解位点，之 后 是 H i s 标签。这个方法适用于其他标签和裂解酶。

(1) 将每一份澄清裂解液移入到两个I.5 m L 重力自流式(gravity-fed)镍螯合树脂柱 ，该树脂柱已被裂解缓冲液预平衡。收集每份流出液于废液盘中。
(2) 加人 7. 5 m L 冲洗缓冲液[50 m m o l / L H E P E S ( p H 8. 0)、 300 m m 〇l/L N a C l 、40 m m o l /L 咪唑、 1 0 % 甘油、 I _ 1 / L T C E P ]。加入 0.5 m L 的洗脱缓冲液[20 m m o l / LH E P E S ( p H 8.0)、 300 m m o l / L 咪唑、 1 0 % 甘油 、I m m o l / L T C E P ]。洗脱缓冲液的体积不应超过树脂床体积的1/3, 其目的是推动缓冲液的洗脱前沿到树脂底部，以减小下一步的洗脱体积。

(3) 将每个柱子放在用消化缓冲液[20 m m ol/L H E PES (p H 8.0)、200 m m ol/LNaCl 40 m m ol/L imidazole、 I m m ol/L T C E P]预平衡的 PIM O 脱盐柱上。加 2. 5 mL洗脱缓冲液到镍螯合树脂中，收集洗脱液直接到PD- 10 柱上。

(4) 再 加 入 3. 5 m L 消化缓冲液, 将蛋白质从 PD 4 0 柱中洗脱，收集洗脱液到 15 mL的一次性管中。取出一小份样品来进行蛋白质检测和 SDS-PA G E 分析。

(5) 接下来通过蛋白酶水解移除 H i s 标 签 。该蛋白酶本身也带有 H i s 标签。因此，后续流过镇树脂将会去除蛋白酶、未经蛋白酶切割的蛋白质，以及那些非特异地粘在镍树脂上的蛋白质，而目标蛋白质得以经过柱子流穿出来。从 P IM O 柱洗脱 的 每 15 m g 蛋白质需要加入 I m g 带 有 H i s 标 签 的 T E V 蛋白酶 (Tropea et aL , 2009)。 用消化缓冲液将消化的总体积补足至 9 m L 。室温翻转混勻 2 h 或 4°C 过夜。

(6) 将每种消化的蛋白质混合物倒人 I .5 m L 用消化缓冲液预平衡的重力自流式镍螯合树脂柱中。将每份流穿液收集到 50 m L 锥形管中。消化后的混合物通过柱子后，树脂中再额外加人 I .5 m L 的消化缓冲液以移除残留的被切割的蛋白质, 并收集到上述同一管中。获 得 的 10. 5 m L 洗脱体积包含去除 H i s 标签的纯化的蛋白质。