【原创】表达蛋白的分离与纯化
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表达蛋白的分离与纯化
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化（融合T7•Tag的表达蛋白）
（一）试剂准备
采用T7• Tag Affinity Purification Kit
1． T7•Tag抗体琼脂。
2． B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。
3. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。
4. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。
5.. PEG 20000。
（二）操作步骤
1. 100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7•Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制
1． 缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。
2． 缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3． 缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。
4． 缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
5．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
6.．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
（二）操作步骤
1． 用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2． 将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。
3． 将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。
4． 包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。
5． 溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化（融合T7•Tag的表达蛋白）
（一）试剂准备
采用T7• Tag Affinity Purification Kit
1． T7•Tag抗体琼脂。
2． B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。
3. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。
4. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。
5.. PEG 20000。
（二）操作步骤
1. 100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7•Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制
1． 缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。
2． 缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3． 缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。
4． 缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
5．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
6.．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
（二）操作步骤
1． 用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2． 将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。
3． 将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。
4． 包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。
5． 溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
