从包涵体中纯化表达蛋白

蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达，常常导致形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体。这些由表达蛋白聚集成的包涵体很容易与可溶性蛋白和膜结合蛋白分离。高水平表达外源蛋白的细菌经离心浓缩后，可通过机械法、超声处理法或溶菌酶加去污剂的方法进行裂解。包涵体经离心沉淀后，可用 Triton X-100 和 EDTA 或用尿素洗涤。多数情况下，调整洗涤条件可使包涵体中外源蛋白的纯度达到 90% 以上。

试剂：

表达靶蛋白的大肠杆菌细胞、细胞裂解缓冲液 I、细胞裂解缓冲液Ⅱ

脱氧胆酸、浓盐酸、包涵体溶解缓冲液 I、包涵体溶解缓冲液Ⅱ、KOH

PMSF、SDS 凝胶加样缓冲液、含尿素的 Tris-Cl DNaseI 溶菌酶

SDS-聚丙烯酰胺凝

仪器：

Sorvall GSA 转头或相当的转头、pH 试纸、磨光玻璃棒

材料缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录。

1. 贮存液稀释至适当浓度。

(1) 细胞裂解缓冲液：150 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）100 mmol/L NaCl。

(2) 细胞裂解缓冲液Ⅱ：冰冷 50 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0）100 mmol/L NaCl 0.5%  TritonX-100，脱氧胆酸使用蛋白级的胆酸/去污剂，HCl（12 mol/L）（浓盐酸）。

(3) 包涵体溶解缓冲液：150 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），100 mmol/L NaCl，8 mol/L 尿素，0.1 mol/L PMSF 缓冲液，现用现配。

(4) 包涵体溶解缓冲液Ⅱ：50 mmol/L KH2PO4（pH 10.7），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），50 mmol/L NaCl，KOH（10 mol/L），PMSF（100 mmol/L），1x 和 2x SDS 凝胶加样缓冲液，不含 DTT 的 1x 和 2x SDS 凝胶加样缓冲液室溫保存，1 mol/L DTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。

(5) 含尿素的 Tris-Cl（0.1 mol/L, pH 8.5）仅限于方法 2 使用，请见步骤 7，配制内含尿素浓度递增（如 0.5、1、2 和 5 mol/L）的 0.1 mol/L Tris-Cl（PH 8.5），使用前用固体尿素现用现配，不能使用任何尿素贮存液，因为尿素容易分解。

(6) 酶和缓冲液：DNaseI（1 mg/mL）与溶菌酶（10 mg/ml）用 Tris-Cl（PH 8.0），现用现配。

(7) 离心机和转头 Sorvall GSA 转头或相当的转头特别配备 pH 试纸备用，请见步骤 10。

(8) 载体和细菌菌株：表达靶蛋白的大肠杆菌细胞培养 1 L，以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞方法制备细胞抽提物 1.1 L，表达细胞培养物于预先称重的离心管中以 5000 g（5500 r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min。

2. 吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液 I，轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3. 每克（湿重）菌体加入 4 μL 100 mmol/L PMSF，80 μL 10 mg/mL 溶菌酶，搅动 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物。

4. 每克（湿重）菌体加入 4 mg 脱氧胆酸，继续搅动。

5. 悬液 37 ℃ 放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变黏时每克（湿重）菌体加入 20 μL 1 mg/mL DNaseI。

6. 裂解液室温放置，直至不再黏稠（约 30 min）。

7. 用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。

方法 ①： 用 Triton X-100 提取包涵体，下述流程是对 Marston 等（1984）所用方法的改进。

a. 细胞裂解物 4 ℃ 高速离心 15 min。

b. 倾倒去除上清，沉淀重悬于 9 倍体积的 4 ℃ 细胞裂解缓冲液Ⅱ。

c. 悬液室温放置 5 min。

d. 高速离心 15 min。

e. 倾倒上清，留置待用。沉淀重悬于 100 μL 水。

f. 各取 10 μL 上清和沉淀，分别与 10μL 2X SDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。

g. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。

方法 ②：用尿素提取包涵体下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体，摘自 Schoner 等（1985）。

a. 细胞裂解物 4 ℃ 高速离心 15 min。注意：步骤 b、d 和 f 必须在 4 ℃ 进行。

b. 倾倒去除上清，每克（湿重）菌体沉淀重悬于 1 mL 水中。每支 100 μL 装 4 支离心管，其余 4 ℃ 保存。

c. 4 ℃ 高速离心 15 min。

d. 毎份沉淀重悬于 100 μL 含不同浓度（如 0.5、1、2 和 5 mol/L）尿素的 0.1 mol/L Tris-Cl（pH8.5）。

e. 4 ℃ 高速离心 15 min。

f. 倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于 100 μL 水中。

g. 各取 10 μL 上清和沉淀，分别与 10 μL 2X SDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。

h. 用步骤 g 确定的最佳浓度，按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀（步骤 b）。

i. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。

8. 取适量步骤 7 的重悬细胞沉淀，4 ℃ 高速离心 15 min, 沉淀重悬于 100 μL 含 0.1 mmol/L PMSF（现用现加）的包涵体溶解缓冲液 I。

9. 室温放置 1 h。

10. 把溶液加入到 9 倍体积的包涵体溶解缓冲液 II 中，室温放置 30 min。检査 pH 是否维持在 10.7, 必要时用 10 mol/L KOH 调节。

11. 用 12 mol/L 盐酸将溶液 pH 调至 8.0, 室温放置至少 30 min。

12. 室温高速离心 15 min。

13. 倾倒上清，留置待用，沉淀重悬于 100 μL 1XSDS 凝胶加样缓冲液。

14. 取 10 μL 上清与 10 μL 2xSDS 凝胶加样缓冲液混和，上清和沉淀分别进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析溶解程度。

1. 最适 pH 值范围为 8.0~9.0 之间；

2. 温度适宜选择 4 ℃；

3. 复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为 0.1~0.2 mg/mL；

4. 复性时间一般为 24-36 小时；

5. 低分子化合物 如 L-Arg 有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris 对蛋白质复性有促进作用；EDTA 可以防止蛋白降解；

6. 首先要获得较高纯度的包涵体；

7. 包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施；

8. 透析前后均要离心；

9. 包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量 Triton-X100；

10. 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性；

11. 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析 12~24 h ；

12. 复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定;

13. TritionX100、SDS 这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用 Triton 洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下 3~4 条杂带，这样后续的纯化就很方便了。

14. 复性时的蛋白浓度一般为 0.1~1 mg/mL，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

一、附加方案，请参考

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二、蛋白质重折叠方法，请参考

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