RNA的分离与纯化
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包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料,mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品,RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。
RNA中rRNA的数量最多,占总量的80%~85%;tRNA及核内小分子RNA占15%~20%;mRNA仅占1%~5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚,从基因克隆、表达与诊断的目的出发,目前对RNA的分离与纯化,主要集中在总RNA与mRNA上。
从RNA提取的初始阶段开始,就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂(如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂)、蛋白的水解酶(如蛋白酶K)和能与蛋白质结合的阴离子去污剂(如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等)并联合使用RNase的特异性抑制剂(如RNasin与DEPC等)能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外,在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)等还原剂可以破坏RNase中的二硫键,有利于RNase的变性、水解与灭活。
总RNA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是,目前常用的一步法均以异丙醇沉淀RNA,由于其选择性地沉淀大分子rRNA和mRNA,故提取的总RNA中含有的小分子量RNA较少,rRNA和mRNA所占的比例相应增高。当然,目前的研究重点不是小分子量RNA,而是分子量较高的mRNA,不必苛求真正的总RNA。
(一)(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法
(异)硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法,由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞,然后在pH4.0的酸性条件下,用酚/氯仿抽提裂解溶液,最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。该法与以前的(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法相比,具有简便、经济和高效的特点,能同时迅速地处理多个标本,且RNA的完整性与纯度均很高。目前仍用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。总RNA的产量取决于标本的起始量,每毫克组织总RNA的产量大约为4~7mg,每10 6 个细胞大约为5~10mg。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA,而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染,这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解,同时抑制RT-PCR反应,并通过结合到膜上而影响RNA杂交中的印迹步骤。脂肪组织RNA的提取可换用(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法。当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时,可下一个方法,通过增加一个有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。
RNA中rRNA的数量最多,占总量的80%~85%;tRNA及核内小分子RNA占15%~20%;mRNA仅占1%~5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚,从基因克隆、表达与诊断的目的出发,目前对RNA的分离与纯化,主要集中在总RNA与mRNA上。
- RNA制备的条件与环境
从RNA提取的初始阶段开始,就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂(如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂)、蛋白的水解酶(如蛋白酶K)和能与蛋白质结合的阴离子去污剂(如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等)并联合使用RNase的特异性抑制剂(如RNasin与DEPC等)能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外,在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)等还原剂可以破坏RNase中的二硫键,有利于RNase的变性、水解与灭活。
- 总RNA的分离与纯化
总RNA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是,目前常用的一步法均以异丙醇沉淀RNA,由于其选择性地沉淀大分子rRNA和mRNA,故提取的总RNA中含有的小分子量RNA较少,rRNA和mRNA所占的比例相应增高。当然,目前的研究重点不是小分子量RNA,而是分子量较高的mRNA,不必苛求真正的总RNA。
(一)(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法
(异)硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法,由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞,然后在pH4.0的酸性条件下,用酚/氯仿抽提裂解溶液,最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。该法与以前的(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法相比,具有简便、经济和高效的特点,能同时迅速地处理多个标本,且RNA的完整性与纯度均很高。目前仍用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。总RNA的产量取决于标本的起始量,每毫克组织总RNA的产量大约为4~7mg,每10 6 个细胞大约为5~10mg。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA,而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染,这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解,同时抑制RT-PCR反应,并通过结合到膜上而影响RNA杂交中的印迹步骤。脂肪组织RNA的提取可换用(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法。当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时,可下一个方法,通过增加一个有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。