技术和方案6 酵母 RNA 的分离

大量 RNA 分离程序

酵母总 RNA 的分离

1.在每毫升培养物中加入 50ug 环乙酰亚胺，在 30°C 下摇晃 15 min。此步骤亦可省略，但是有人认为此步可防止 mRNA 凝集在多聚核糖体上。

2.迅速冷却收集细胞，在大离心瓶（Sorvall GS 或类似型号）中加入约一半体积的碎冰，将培养物倒入至盖过冰面，振荡，4°C，5000r/min 离心 5 min。

3.加人 llg 酸洗过的玻璃珠于 30 ml 离心管中，以 Corex 玻璃离心管为最佳，塑料离心管也能使用。

4.加入 3 ml 已用 LETS 缓冲液平衡的苯酚到玻璃珠中。

5.用 2.5 ml 冰预冷的 LETS 缓冲液悬浮细胞，并将其加入到上述玻璃珠/苯酚管中，为了使细胞达到最好的破碎效果，液面应刚好高于玻璃珠表面。

6.最高速振荡 30s 后，在冰上放置 30s，如此交替进行 3 min。用相差显微镜检测细胞破碎情况，破碎的细胞呈现无折射的空细胞形态。

7.当至少 90% 细胞破碎后，加5 ml 冰预冷的 LETS 缓冲液，轻微振荡，用 SorvallSS-34 转头以 8000r/min 离心 5 min，使溶液分相。离心后，酚层和蛋白质界面应刚好低于玻珠表面，以便容易地吸出水相而不会扰动界面。

8.将水相转到一个干净离心管，用 5 ml 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1) 抽提 2 次，避免带人界面。如需要，可用氯仿再抽提一次。

9.加入 1/10 体积的 5mol/L 氯化锂，在一 20°C 下沉淀 3 h。RNA 沉淀可保存在该温度下。

Poly(A)RNA 的分离

1.将保存的 RNA 用 SorvallSS-34 转头以 10000r/min 离心 lOmin，收集 RNA 沉淀，用 80% 乙醇洗涤。真空干燥后，溶于 2.5 ml 蒸馏水中。完全溶解后，加入 2.5 ml 2X 上样缓冲液，同时加 SDS 至终浓度为 0.3%。

2.65°C 加热 5 min。

3.将样品加到一个 oligo(dT) 柱，用 1 X 上样缓冲液洗 3 次。

4.用 10mmol/L HEPES (pH7) 洗脱 Poly(A)⁺RNA。如果希望得到更满意的结果，可以加人 RNase 抑制剂。

5.用蒸馏水对 Poly(A)⁺RNA 进行 10 倍稀释，通过 OD26Q 的光吸收测定 RNA 浓度。

用水将 10 mmol/LHEPES(pH7) 稀释 10 倍（lmmol/LHEPES) 作为对照。

6.加 1/10 体积 3md/L 乙酸钠和 2.5 倍体积无水乙醇沉淀 RNA，上下倒置混匀，在一 70°C 下放置 30 min。离心 lOmin，弃上清液。用蒸馏水溶解 RNA 沉淀使终浓度为 lmg/ml。无论是溶解的 RNA 或是乙醇沉淀的 RNA 都能在一 70 〇 C 下长期保存

快速小量 RNA 的分离

1.将 7.5X10⁷ 个细胞的过夜培养物接种于 50 ml YPD 培养基。

2.在适当的温度和转速下培养细胞到要求的浓度。在收集细胞之前可转移到不同的温度。细胞密度不应超过 1.5X10⁷ 个/ml 或者 00_值不超过 1.5。计算细胞密度有利于后期比较相对的 RNA 表达水平。（附录 G，用标准血球计数板进行酵母细胞计数)

3.4°C 下，3000 g 离心 3 mm 收集细胞。弃上清后，用 1ml 预冷的 AE 缓冲液重悬细胞。迅速转移细胞到一个离心管中，16000 g，离心 10s。弃上清，再用 lml 预冷的 AE 缓冲液重悬细胞，重复此步骤。

注意：细胞必须尽可能快地预冷。并且在整个操作过程中都应保证在冰上操作以减少 RNA 的降解。

4.用 4004 预冷的 AE 缓冲液重悬细胞，并加入 40ul 10% 的 SDS 充分混匀。再加入 440^1 预先用 AE 缓冲液平衡的苯酚溶液 (pH5.2) 充分混匀。

5.准备干冰/95% 乙醇浴：干冰压成粉末后，缓慢加到 95% 的乙醇中，直到乙醇溶液呈厚糊状为止。

6.在该干冰/95% 乙醇浴上快速冷冻细胞 5 min 后，将细胞转移到 65°C 水浴 5 min。振荡裂解物 30s 并重复该冻融振荡过程。

7.再次在干冰/95% 乙醇浴上快速冷冻细胞 5 min。

8.裂解物在室温下 16000 g 离心 7 min。如果有机相和水相不能完全分层（有大量白色绒毛状悬浮物），则再在 16000 g 离心 5 min。若仍然不能有效分层，则补加 10ul 预冷的 AE 缓冲液和 100ul 苯酚（pH5.2) 后，再在室温下 16000 g 离心 5 min。转移水层到一个新的离心管。

9.加入 600ul 酚（pH5.2)-氯仿-异戊醇（25:24:1) 抽提，混悬振荡后，室温下 16OOOg 离心 5 min。转移水层到新离心管。

10.加入 50ul 3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 1ml 预冷的无水乙醇以沉淀 RNA。-20°C 冷冻 RNA 20 min。RNA 可在无乙酸钠的无水乙醇中保存于 -70°C 备用。

11.4°C 下，16000 g 离心 15 min。弃尽上清，并用 1ml 预冷的 80% 的乙醇洗一次。16000 g 离心 15 min，弃尽上清（移除所有的液体以减少盐污染）。真空离心干燥 RNA(5~10min) 并用 100ul 双蒸水重悬。

12) 以 260nm 和 280nm 的吸收值来确定 RNA 浓度和纯度。OD260/280值在 1.7~2.0 表明 RNA 的纯度为可接受的。labs. 单位=38ug RNA。RNA 产量一般在 50~200ug。

注意：上述方法中所涉及的容器都必须用 RNaseAway(LPS) 预洗后 160°C 干烤 24 h。所有的水试剂在灭菌前都必须按 1:1000(V/V) 的比例加入焦碳酸二乙酯以灭活 RNA 酶。