酵母遗传学方法3：RNA的分离

酵母 RNA 的分离

 

1 ）总酵母 RNA 的分离

 

1． 在每毫升培养物中加入 50 μ g 环乙酰亚胺，在 30 ℃下振荡 15 分钟。此步亦可省略，但是有人认为环乙酰亚胺可防止 mRNA 凝集在多核糖体上。

2． 迅速冷冻收集细胞，在大离心管中加入约一半体积的碎冰，将培养物倒入，振荡，在 4 ℃下以 5000r/min 离心 5 分钟。

3． 加入 11g 玻珠于 30ml 离心管中，以 Corex 玻璃离心管为最佳，不过塑料离心管也能使用。

4． 加入 3ml 已用 LETS 缓冲液平衡的苯酚到玻珠中。

LETS 缓冲液：

0.1 mol/L 氯化锂

0.01  mol/L Na₂ EDTA

0.01  mol/L Tris-HCl (pH7.4)

0.2% SDS

0.1% 二乙基焦碳酸（可任选）

5． 用 2.5ml 冰预冷的 LETS 缓冲液悬浮细胞，并将其加入到上述玻珠苯酚管中。为了使细胞破碎的最好，液面应刚好高于玻珠表面。

6． 高速振荡 30 秒后，在冰上置 30 秒，交替进行 3 分钟，用相差显微镜检测细胞破碎情况，破碎的细胞呈现无折射的空细胞。

7． 当至少 90% 细胞破碎后，用 5ml 冰预冷的 LETS 缓冲液，轻微振荡，用 Sorvall SS － 34 转头以 8000r/min 离心 5 分钟，使溶液分相。离心后，酚层和蛋白质界面应刚好低于玻珠表面，移出水相而不会触动界面。

8． 将水相转到一个干净离心管，用 5ml 苯酚：氯仿：已戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）抽提 2 次，避免触动界面。用氯仿抽提一次。

9． 加入 1/10 体积的 5mol/L 氯化锂，在－ 20 ℃下沉淀 3 小时。此时， RNA 沉淀可在－ 20 ℃下存放。

 

 

2 ） Poly(A)⁺ RNA 的分离

 

1． 将保存的 RNA 用 Sorvall SS-34 转头以 10 000r/min 离心 10 分钟，收集 RNA 沉淀，用 80 ％乙醇洗涤。真空干燥后，溶于 2.5ml 蒸馏水中，溶解后加入 2.5ml 2 ×上样缓冲液，同时加 SDS 至终浓度为 0.3 ％。

2． 置 65 ℃保温 5 分钟。

3． 装一个 oligo （ dT ）柱，用 1 ×上样缓冲液洗 3 次。

4． 用 10mmol/L HEPES （ pH7 ）洗脱 Poly （ A ）^＋ RNA 。如果希望得到更满意的结果，可用加入 RNase 抑制剂。

5． 用蒸馏水对 Poly （ A ）^＋ RNA 进行 10 倍稀释，通过 OD₂₆₀ 的光吸收测定 RNA 浓度。用水将 10mmol/L HEPES(pH7) 稀释 10 倍作为对照。

6． 加 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠和 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA ，上下倒置混匀，在－ 70 ℃下放置 30 分钟。离心 10 分钟，弃上清液，用水溶解 RNA 沉淀使终浓度为 1mg/ml 。不管是溶解的 RNA 或是乙醇沉淀的 RNA 都能在－ 70 ℃下长期保存。