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酵母遗传学方法1:DNA分离

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1865

 

酵母 DNA 分离

 

1 )酵母 DNA 微量制备( 40ml

 

1. 125ml 三角瓶中用 40ml YPD 培养液在 30 ℃条件下培养细胞达最大生长量(过夜)。

2. 将上述培养物移入螺盖离心管,用医用离心机或 Sorvall SS 34 转头以 5000r/min 离心 5 分钟,弃去上清液。

3. 将细胞悬浮在 3ml 0.9mol/L 山梨醇- 0.1mol/L Na2 EDTA(pH7.5) 溶液中。

4. 0.1ml 2.5mg/ml 消解酶 100T ,置 37 ℃条件保温 1 小时。

5. 用医用离心机或 Sorvall SS 34 转头以 5000r/min 离心 5 分钟,弃去上清液。

6. 将细胞重新悬浮在 5ml 50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L 醋酸钠溶液中。

7. 0.5ml 10 %十二烷基硫酸钠( SDS ),混匀。

8. 65 ℃保温 30 分钟。

9. 1.5ml 5mol/L 醋酸钾溶液,在冰浴上放置 1 小时。

10.  Sorvall SS 34 转头以 1000r/min 离心 10 分钟。

11.  将上清液转移至干净的塑料离心管中,室温下加入两倍体积的 95 %乙醇,混匀,以 5000 6000r/min 离心 15 分钟。

12.  弃上清液,将沉淀物干燥,然后悬浮在 3ml TE 缓冲液( pH7.4 )中,此操作可能需要几个小时。

13.  Sorvall SS 34 转头以 1000r/min 离心 15 分钟,将上清液转移到一个新试管,弃沉淀物。

14.  加入 150 μ l 1mg/ml RNaseA 溶液,在 37 ℃下保温 30 分钟。

15.  加入一倍体积的 100 %异丙醇,轻轻混匀,取出呈松散纤维状的沉淀物,无需离心,让其自然干燥。

16.  将沉淀物悬浮在 0.5ml TE 缓冲液( pH7.4 )中,置 4 ℃保存。酵母 DNA 的最终浓度约为 200 μ g/ml 。如果最后的溶液混浊不清,用异丙醇再次沉淀 DNA 或用 Sorvall SS 34 转头以 1000r/min 离心 15 分钟。

 

 

2 )酵母 DNA 微量制备( 5ml

 

1. 按酵母于 5ml YPD 中,置 30 ℃培养过夜。

2. 用医用离心机以 2000r/min 离心 5 分钟沉淀细胞,弃上清液。

3. 将细胞悬浮在 0.5ml 1mol/L 山梨醇- 0.1mol/L Na2 EDTA(pH7.5) 缓冲液中,转动一支 1.5ml 离心管中。

4. 加入 0.02ml 2.5mg/ml 的消解酶 100T 溶液,置 37 ℃保温 1 小时。

5. 离心 1 小时。

6. 弃上清液,把细胞悬浮在 0.5ml 50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2 EDTA 溶液。

7. 0.05ml 10 SDS ,混匀。

8. 65 ℃保温混合物 30 分钟。

9. 0.2ml 5mol/L 醋酸钾,把离心管在冰浴中放置 1 小时。

10.  离心 5 分钟。

11.  将上清液转移到一洁净微型离心管,室温下加入等体积的无水异丙醇,混匀,放置 5 分钟。短暂离心( 10 秒钟)弃上清液,让沉淀自然干燥。

12.  0.3ml TE 缓冲液( pH7.4 )重新悬浮沉淀。

13.  加入 15 μ l 1mg/ml RNaseA 溶液,置 37 ℃保温 30 分钟。

14.  0.03ml 3mol/L 醋酸钠,混匀,用 0.2ml 的无水异丙醇沉淀,再短暂离心收集 DNA

15.  弃上清液,自然干燥,用 0.1 0.3ml TE 缓冲液( pH7.4 )重新悬浮 DNA

16.  在使用限制性内切酶酶解 DNA 之前,有必要将最终浓度溶液离心较长时间( 15 分钟)以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

 

 

3 10 分钟制备酵母 DNA 方法

 

大肠杆菌或酵母转化质粒的制备

 

1. 在质粒 DNA 选择性培养基中,置 30 ℃培养少量培养物过夜。

2. 将培养物转入一支 1.5ml 的微型离心管,离心 5 秒,收集细胞。

3. 小心倾去上清液,轻弹离心管,使沉淀重新悬浮于残余培养液中。

4. 加入 0.2ml 2 Triton X 100 1 SDS 100mmol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCl(pH8) 1mmol/L Na2 EDTA ;加入 0.2ml 的苯酚:氯仿:已戊醇( 25 24 1 );加入 0.3g 酸洗过的玻珠。

5. 振荡 2 分钟。

6. 离心 5 分钟。

7. 1 5 μ l DNA 的水相转化 0.2ml 的大肠杆菌受体菌,用 15 μ l 水相转化酵母菌。

 

 

用于 Southern 分析的基因组 DNA 分离

 

1. YPD 培养基,置 30 ℃培养 10ml 酵母至最大生长量。

2. 用医用离心机离心 2 分钟,弃上清液,收集细胞,用 0.5ml 蒸馏水重新悬浮,将细胞转入 1.5ml 微型离心管中,离心 5 秒收集细胞。

3. 重复第二步。

4. 重复第二步。

5. 0.2ml TE 缓冲液( pH8 ),振荡 3 4 分钟。

6. 离心 5 分钟,将水相移至洁净试管,加 1ml 的无水乙醇,上下倒置,混合均匀。

7. 离心 2 分钟,弃上清液,悬浮在 0.4ml TE 缓冲液和 3 μ l 10mg/ml RNase A 溶液,置 37 ℃保温 5 分钟,加入 10 μ l   4mol/L 醋酸铵和 1ml 的无水乙醇,上下倒置,混匀。

8. 离心 2 分钟,弃上清液,自然干燥后,用 50 μ l TE 缓冲液悬浮,每份样品用 10 μ l 进行 Southern 印迹分析,每份用量约 2 4 μ g DNA

 

 

4 )酵母基因组 DNA :玻珠制备法

 

1. 5ml 培养基在 30 ℃下,摇床培养过夜。

2. 转移培养物至 13mm × 100mm 的玻璃离心管中,用台式离心机以 1500r/min 离心 5 分钟,收集细胞。

3. 3ml 无菌水洗细胞,同上离心。

4. 500 μ l 裂解缓冲液再次悬浮。

5. 加入干净玻珠(约 1.5ml Eppendorf 离心管的 2/3 体积)和 25 μ l 5mol/L NaCl

6. 以最高速振荡 1 分钟。

7. 2000r/min 离心 2 分钟。

8. P-1000 移液器转移上清液至一支 1.5ml 的离心管。

9. 加入 500 μ l 苯酚,振荡,离心 1 分钟。用 P-1000 移液器吸取水相,转移至洁净离心管,加入 500 μ l SEVAG (氯仿:已戊醇, 24 1 ),同上振荡,离心,抽提。

10.  加入 1ml 95 %的冷冻乙醇,在 -20 ℃下沉淀 1 小时。

11.  以最高转速离心沉淀 DNA ,弃上清液,用 70 %乙醇清洗,最后悬浮在 250 μ l TE 缓冲液中。

12.  25 μ l EDTA-Sark 5 μ l 的蛋白酶 K 10mg/ml ),置 37 ℃保温 30 分钟。

13.  250 μ l 5mol/L 醋酸铵,重复 9 10 步骤。

14.  收集 DNA ,用 70 %乙醇洗,悬浮于 100 μ l TE 缓冲液。

 

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