酵母遗传学方法1：DNA分离

酵母 DNA 分离

 

1 ）酵母 DNA 微量制备（ 40ml ）

 

1． 在 125ml 三角瓶中用 40ml YPD 培养液在 30 ℃条件下培养细胞达最大生长量（过夜）。

2． 将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或 Sorvall SS － 34 转头以 5000r/min 离心 5 分钟，弃去上清液。

3． 将细胞悬浮在 3ml 的 0.9mol/L 山梨醇－ 0.1mol/L Na₂ EDTA(pH7.5) 溶液中。

4． 加 0.1ml 的 2.5mg/ml 消解酶 100T ，置 37 ℃条件保温 1 小时。

5． 用医用离心机或 Sorvall SS － 34 转头以 5000r/min 离心 5 分钟，弃去上清液。

6． 将细胞重新悬浮在 5ml 的 50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L 醋酸钠溶液中。

7． 加 0.5ml 的 10 ％十二烷基硫酸钠（ SDS ），混匀。

8． 置 65 ℃保温 30 分钟。

9． 加 1.5ml 的 5mol/L 醋酸钾溶液，在冰浴上放置 1 小时。

10．  用 Sorvall SS － 34 转头以 1000r/min 离心 10 分钟。

11．  将上清液转移至干净的塑料离心管中，室温下加入两倍体积的 95 ％乙醇，混匀，以 5000 ～ 6000r/min 离心 15 分钟。

12．  弃上清液，将沉淀物干燥，然后悬浮在 3ml TE 缓冲液（ pH7.4 ）中，此操作可能需要几个小时。

13．  用 Sorvall SS － 34 转头以 1000r/min 离心 15 分钟，将上清液转移到一个新试管，弃沉淀物。

14．  加入 150 μ l 的 1mg/ml RNaseA 溶液，在 37 ℃下保温 30 分钟。

15．  加入一倍体积的 100 ％异丙醇，轻轻混匀，取出呈松散纤维状的沉淀物，无需离心，让其自然干燥。

16．  将沉淀物悬浮在 0.5ml TE 缓冲液（ pH7.4 ）中，置 4 ℃保存。酵母 DNA 的最终浓度约为 200 μ g/ml 。如果最后的溶液混浊不清，用异丙醇再次沉淀 DNA 或用 Sorvall SS － 34 转头以 1000r/min 离心 15 分钟。

 

 

2 ）酵母 DNA 微量制备（ 5ml ）

 

1． 按酵母于 5ml YPD 中，置 30 ℃培养过夜。

2． 用医用离心机以 2000r/min 离心 5 分钟沉淀细胞，弃上清液。

3． 将细胞悬浮在 0.5ml 的 1mol/L 山梨醇－ 0.1mol/L Na₂ EDTA(pH7.5) 缓冲液中，转动一支 1.5ml 离心管中。

4． 加入 0.02ml 的 2.5mg/ml 的消解酶 100T 溶液，置 37 ℃保温 1 小时。

5． 离心 1 小时。

6． 弃上清液，把细胞悬浮在 0.5ml 的 50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na₂ EDTA 溶液。

7． 加 0.05ml 的 10 ％ SDS ，混匀。

8． 置 65 ℃保温混合物 30 分钟。

9． 加 0.2ml 的 5mol/L 醋酸钾，把离心管在冰浴中放置 1 小时。

10．  离心 5 分钟。

11．  将上清液转移到一洁净微型离心管，室温下加入等体积的无水异丙醇，混匀，放置 5 分钟。短暂离心（ 10 秒钟）弃上清液，让沉淀自然干燥。

12．  用 0.3ml TE 缓冲液（ pH7.4 ）重新悬浮沉淀。

13．  加入 15 μ l 的 1mg/ml 的 RNaseA 溶液，置 37 ℃保温 30 分钟。

14．  加 0.03ml 的 3mol/L 醋酸钠，混匀，用 0.2ml 的无水异丙醇沉淀，再短暂离心收集 DNA 。

15．  弃上清液，自然干燥，用 0.1 ～ 0.3ml TE 缓冲液（ pH7.4 ）重新悬浮 DNA 。

16．  在使用限制性内切酶酶解 DNA 之前，有必要将最终浓度溶液离心较长时间（ 15 分钟）以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

 

 

3 ） 10 分钟制备酵母 DNA 方法

 

大肠杆菌或酵母转化质粒的制备

 

1． 在质粒 DNA 选择性培养基中，置 30 ℃培养少量培养物过夜。

2． 将培养物转入一支 1.5ml 的微型离心管，离心 5 秒，收集细胞。

3． 小心倾去上清液，轻弹离心管，使沉淀重新悬浮于残余培养液中。

4． 加入 0.2ml 的 2 ％ Triton X － 100 ， 1 ％ SDS ， 100mmol/L NaCl ， 10mmol/L Tris-HCl(pH8) ， 1mmol/L Na₂ EDTA ；加入 0.2ml 的苯酚：氯仿：已戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）；加入 0.3g 酸洗过的玻珠。

5． 振荡 2 分钟。

6． 离心 5 分钟。

7． 用 1 ～ 5 μ l 含 DNA 的水相转化 0.2ml 的大肠杆菌受体菌，用 15 μ l 水相转化酵母菌。

 

 

用于 Southern 分析的基因组 DNA 分离

 

1． 用 YPD 培养基，置 30 ℃培养 10ml 酵母至最大生长量。

2． 用医用离心机离心 2 分钟，弃上清液，收集细胞，用 0.5ml 蒸馏水重新悬浮，将细胞转入 1.5ml 微型离心管中，离心 5 秒收集细胞。

3． 重复第二步。

4． 重复第二步。

5． 加 0.2ml TE 缓冲液（ pH8 ），振荡 3 ～ 4 分钟。

6． 离心 5 分钟，将水相移至洁净试管，加 1ml 的无水乙醇，上下倒置，混合均匀。

7． 离心 2 分钟，弃上清液，悬浮在 0.4ml TE 缓冲液和 3 μ l 的 10mg/ml 的 RNase A 溶液，置 37 ℃保温 5 分钟，加入 10 μ l   4mol/L 醋酸铵和 1ml 的无水乙醇，上下倒置，混匀。

8． 离心 2 分钟，弃上清液，自然干燥后，用 50 μ l 的 TE 缓冲液悬浮，每份样品用 10 μ l 进行 Southern 印迹分析，每份用量约 2 ～ 4 μ g DNA 。

 

 

4 ）酵母基因组 DNA ：玻珠制备法

 

1． 用 5ml 培养基在 30 ℃下，摇床培养过夜。

2． 转移培养物至 13mm × 100mm 的玻璃离心管中，用台式离心机以 1500r/min 离心 5 分钟，收集细胞。

3． 用 3ml 无菌水洗细胞，同上离心。

4． 用 500 μ l 裂解缓冲液再次悬浮。

5． 加入干净玻珠（约 1.5ml Eppendorf 离心管的 2/3 体积）和 25 μ l 的 5mol/L NaCl 。

6． 以最高速振荡 1 分钟。

7． 用 2000r/min 离心 2 分钟。

8． 用 P-1000 移液器转移上清液至一支 1.5ml 的离心管。

9． 加入 500 μ l 苯酚，振荡，离心 1 分钟。用 P-1000 移液器吸取水相，转移至洁净离心管，加入 500 μ l SEVAG （氯仿：已戊醇， 24 ： 1 ），同上振荡，离心，抽提。

10．  加入 1ml 的 95 ％的冷冻乙醇，在 -20 ℃下沉淀 1 小时。

11．  以最高转速离心沉淀 DNA ，弃上清液，用 70 ％乙醇清洗，最后悬浮在 250 μ l TE 缓冲液中。

12．  加 25 μ l 的 EDTA-Sark 和 5 μ l 的蛋白酶 K （ 10mg/ml ），置 37 ℃保温 30 分钟。

13．  加 250 μ l 的 5mol/L 醋酸铵，重复 9 、 10 步骤。

14．  收集 DNA ，用 70 ％乙醇洗，悬浮于 100 μ l 的 TE 缓冲液。