技术和方案3 酵母 DNA 分离

一、酵母 DNA 微量制备（40 ml)

1.在 125 ml 三角瓶中用 40 mlYPD 培养液在 30°C 条件下培养细胞达最大生长量（过夜)。

2.将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或 SarvallSS-34 转头以 5000r/mm 离心 5 min，弃去上清液。

3.将细胞悬浮在 3 ml 的 0.9mol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5) 溶液中。

4.加 0.lml 的 2.5 mg/ml 消解酶 100T，置 37°C 保温 lh。

5.用医用离心机或 SorvallSS-34 转头以 5000r/min 离心 5 min，弃去上清液。

6.将细胞重悬于 5 ml 的 50 mmol/LTris-HC1(pH7.4)-20 mmol/LNa2EDTA 溶液中。

7.加 0.5 ml 的 10% SDS，混匀。

8.置 65°C 保温 30 min。

9.加 1.5 ml 的 5mol/L 乙酸钾溶液，在冰浴中放置 lh。

10.用 SorvallSS~34 转头以 10000r/min 离心 lOmin。

11.将上清液转移至干净的塑料离心管中，室温下加入两倍体积的 95% 乙醇，混勻，以 5000?6000r/min 室温离心 15 min。

12.弃上清液，将沉淀物干燥，然后悬浮在 3 mlTE 缓冲液（PH7.4) 中，此操作可能需要几个小时。

13.用 SorvallSS-34 转头以 10000r/mm 离心 15 min，将上清液转移到一个新试管，弃沉淀物。

14.加入 150jul 的 lmg/irilRNaseA 溶液，在 37°C 下保温 30 mino

15.加入一倍体积的 100% 异丙醇，轻轻混匀。取出呈松散纤维状的沉淀物，无需离心，让其自然干燥。

16.将沉淀物悬浮在 0.5 mlTE 缓冲液（pH7.4) 中，置 4°C 保存。酵母 DNA 的终浓度大约在 ZOOjug/ml。如果最后的溶液不澄清，用异丙醇再次沉淀 DNA 或用 SorvallSS-34 转头以 10000r/min 离心 15 min。

二、酵母 DNA 微量制备（5 ml）

1.接种酵母于 5 ml YPD 中，置 30°C 培养过夜。

2.用医用离心机以 2000r/min 离心 5 min 沉淀细胞，弃上清液。

3.将细胞悬浮在0.5 ml 的 lmol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5) 缓冲液中，并转到一支 1.5 ml 离心管中。

4.加入 0.02 ml 的 2.5 mg/ml 的消解酶 100T 溶液，置 37°C 保温 lh。

5.离心 lmin。

6.弃上清液，把细胞用 0.5 ml 的 50 mmol/LTrls-Ha(pH7.4)-20 mmol/LNa2EDTA 溶液悬浮。

7.加 0.05 ml 的 10%SDS，混匀。

8.置 65°C 保温混合物 30 min。

9.加 0.2 ml 的 5mol/L 乙酸钾，把离心管在冰浴中放置 lh。

10.离心 5 min 。

11.将上清液转移到一洁净微型离心管，室温下加入等体积的无水异丙醇，混匀，放置 5 min。短暂离心（10s) 弃上清液，让沉淀自然干燥。

12.用 0.3 mlTE 缓冲液（pH7.4) 重新悬浮沉淀。

13.加 15ul 的 lmg/ml 的 RNaseA 溶液，置 37°C 保温 30 min(此步可任意选择）。

14.加 0.03 ml 的 3mol/L 乙酸钠，混匀，用 0.2 ml 的无水异丙醇沉淀，再短暂离心收集 DNA。

15.弃上清液，自然干燥，用 0.1~0.3 ml TE 缓冲液（pH7.4) 重新悬浮 DNA。

16.在使用限制性内切酶酶解 DNA 之前，有必要将最终溶液离心较长时间（15 min) 以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

三、10 min 制备酵母 DNA

大肠杆菌或酵母转化质粒的制备

1.在质粒 DNA 选择性培养基（如 SC-ura) 中，置 30°C 培养少量培养物（至少 1.4 ml) 过夜。

2.将培养物转人一支 1.5 ml 的微型离心管，离心 5s，收集细胞。

3.小心倾去上清液，轻弹离心管，使沉淀重新悬浮于残余培养液中。

4.加人 0.2 ml 的 2%TritonX-100，1%SDS，100 mmol/LNaCl，10 mmol/LTris-HCl(pH8)，lmmol/LNa2EDTA; 加入 0.2 ml 的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1); 加人0.3 g 酸洗过的玻璃珠。

5.振荡 2 min。

6.离心 5 min。

7.用 1~5ul 含 DNA 的水相转化 0.2 ml 的大肠杆菌受体菌，用 15W 水相转化酵母菌。

用于 Southern 分析的基因组 DNA 分离

1.用 YPD 培养基，置 30°C 培养 10 ml 酵母至最大生长量。

2.用医用离心机离心 2 mm，弃上清液，收集细胞，用 0.5 ml 蒸馏水重新悬浮，将细胞转入 1.5 ml 微型离心管中，离心 5s 收集细胞。

3.重复第 2) 步。

4.重复第 2) 步。

5.加 0.2 mlTE 缓冲液（pH8)，振荡 3~4 min。

6.离心 5 mm，将水相移至洁净试管，加 lml 的无水乙醇，上下颠倒，混合均匀。

7.离心 2 min，弃上清液，悬浮在 0.4 ml TE 缓冲液和 3ul 的 10 mg/ml RNase A 溶液，置 37°C 保温 5 mm, 加入 10；ul 4 mol/L 乙酸铵和 lml 的无水乙醇，上下颠倒，混合均匀。

8.离心 2 min，弃上清液，自然干燥后，用 50ul 的 TE 缓冲液悬浮，每份样品用 lOul 进行 Southern 印迹分析，每份用量 2~4ug DNA。

四、制备酵母基因组 DNA: 玻璃珠法

1.用 5 ml 培养基（完全培养基或选择性培养基）在 30°C 下，摇床培养过夜。

2.转移培养物至 13 mmX100 mm 的玻璃离心管中，用台式离心机以 1500r/min 离心 5 min，收集细胞。

3.用 3 ml 无菌水洗细胞，同上离心。

4.用 500ul 裂解缓冲液再次悬浮。

5.加入干净的玻璃珠（约 1.5 ml 离心管的 2/3 体积）和 25ul的 5mol/L Naa。

6.以最高速振荡 lmin。

7.以 2000r/min 离心 2 min。

8.用 P-1000 移液器转移上清液至 1 支 1.5 ml 离心管。

9.加入 500ul 苯酰，振荡，离心 lmin。用 P-1000 移液器吸取水相（上层），转移至洁净离心管，加入 500ul SEVAG(氯仿：异戊醇，24:1)，同上振荡，离心，抽提。

10.加人 lml 预冷的 95% 乙醇，在 -20°C 下沉淀 lh。

11.以最高转速离心 5 min 沉淀 DNA，弃上清液，用 70% 乙醇清洗，最后悬浮在 250ul TE 缓冲液中。

12.加的 EDTA-Sark 和 5ul 的蛋白酶 K(10 mg/ml)，至 37°C 保温 30 min。

13.加 250ul 5mol/L 乙酸铵，重复 9)、10) 步骤。

14.收集 DNA，用 70% 乙醇洗，悬浮于 100ul 的 TE 缓冲液（每个酶解反应使用约 10ul）。