酵母遗传学方法实验

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一、酵母 DNA 微量制备（40 ml) 1.在 125 ml 三角瓶中用 40 mlYPD 培养液在 30°C 条件下培养细胞达最大生长量（过夜)。 2.将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或 SarvallSS-34 转头以 5000r/mm 离心 5 min，弃去上清液。 3.将细胞悬浮在 3 ml 的 0.9mol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2E

1.从液体培养物中或用细菌接种环在平板表面刮菌，收集大约 2.5 OD的细胞量（大约 2.3 mg 湿重）。将细胞重悬于 100ul 蒸馏水中，加入 100ul O.2mol/L NaOH，将样品室温放置 5 min。 2.离心沉淀样品，并将其重悬于 50ul PAGE 样品缓冲液中。将样品于沸水中煮 3 min 并再次离心沉淀。用移液器吸取含有蛋白质的上清，每个泳道用 6ul 上清上样，在小型

1.培养 3~6L 细胞至浓度为 2X107~3X107 个/ml(OD50=1.0~1.3)。 2.离心收集细胞，并用冰预冷的水洗一次。 3.用冰预冷的 NP-40 缓冲液再洗一次后，转移到 50 ml 的离心管中。 4.离心收集细胞，用 10 ml NP-40 缓冲液重新悬浮细胞。 5.向干冰预冷的研磨杵和臼中加入液氮。在液氮挥发时，逐滴往磨臼内加入细胞。并注意添加液氮以保持细胞的冷冻

大量 RNA 分离程序 酵母总 RNA 的分离 1.在每毫升培养物中加入 50ug 环乙酰亚胺，在 30°C 下摇晃 15 min。此步骤亦可省略，但是有人认为此步可防止 mRNA 凝集在多聚核糖体上。 2.迅速冷却收集细胞，在大离心瓶（Sorvall GS 或类似型号）中加入约一半体积的碎冰，将培养物倒入至盖过冰面，振荡，4°C，5000r/min 离心 5 m

1.临用之前制备羟胺溶液，置冰上待用。 2.将用 CsCl 纯化的 10 埤质粒 DNA 加到含 500ul 羟胺溶液的微量离心管中。 3.在 37°C 下温育 20 h。 4.加人 10ul 的 5mol/L NaCl，50 ul 1mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA) 和 1ml 无水乙醇以终止反应，置 -70°C 10 min 以沉淀 DNA。 5.离心 10min，小心倾其所有上清

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鬼笔环肽专一性地结合 F 肌动蛋白，荧光标记的鬼笔环肽染细胞与肌动蛋白抗体的染色模式类似。 1.在 500 ml 三角瓶中振荡培养 25 ml 酵母菌至密度为 2X107 个/ml。 2.添加 17 ml 10% 甲醛（EM 电子显微级）到培养基中至终浓度 4%，在酵母菌生长温度下固定细胞 10 min。 3.2000~3000r/min 离心 5 min，收集细胞。 4.在 6 ml 加

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1.从培养瓶中取 1 ml 细胞培养物，置于微量离心管中。如果有必要，稀释细胞至OD660<1。 2.超声细胞确保细胞计数准确，转移细胞到测量杯中。用细胞生长培养基作为空白对照，在测量样品前将吸光度调零。 3.测量每个样品的 OD660。 4.按照表 16.1 的方法计算单倍体细胞密度，二倍体细胞的密度是单倍体细胞密度的一半。 注意：在不同的

1.培养要分析的细胞。每一个样品，需要在三角瓶中培养 50~100ml 细胞至 OD600 大约为 1。 2.甲醛处理细胞交联蛋白质和 DNA。加甲醛到细胞中至终浓度为 1%(37% 的甲醛按 1:36 与细胞悬液混合），在室温维持 10~120 min，期间颠倒几次。 >注意：最佳的固定时间对不同的蛋白质是不同的，对于不同的分析要加以优化。 3.制备加有蛋白酶抑制剂的裂解/免疫沉淀缓

1.生长和收集细胞。细胞生长至 5X106 个/ml，离心收集 10 ml 样品，并用 5 mlTE 缓冲液洗一次。再次离心收集并悬浮在 1.5 ml 水中。 2.乙醇固定细胞。每份 1.5 ml 样品中加人 3.5 ml 无水乙醇，使乙醇的终浓度达 70%。 在室温中放置 1h，如有必要，可在 4°C 放置样品。 3.洗去乙醇并超声波处理分散细胞。离心收集细胞并用 5 ml TE 缓冲液洗

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