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技术和方案19 酵母 DNA 流式细胞记数

相关实验:酵母遗传学方法实验

最新修订时间:

材料与仪器

TE 缓冲液 胃蛋白酶溶液 SYTOX Green 染色缓冲液

步骤

1.生长和收集细胞。细胞生长至 5X106 个/ml,离心收集 10 ml 样品,并用 5 mlTE 缓冲液洗一次。再次离心收集并悬浮在 1.5 ml 水中。

2.乙醇固定细胞。每份 1.5 ml 样品中加人 3.5 ml 无水乙醇,使乙醇的终浓度达 70%。

在室温中放置 1h,如有必要,可在 4°C 放置样品。

3.洗去乙醇并超声波处理分散细胞。离心收集细胞并用 5 ml TE 缓冲液洗一次。超声波处理分散细胞(每次 5~10s,共 3 轮)

4.核酸酶处理细胞。Tris 缓冲液稀释核酸酶储存液至 1mg/ml(IX)。离心收集细胞,移去缓冲液并加入 2 ml IX 核酸酶溶液重新悬浮。37°C 振荡温育样品 lh,如有必要可 4°C 过夜。核酸酶消化充分十分关键,这一步可以通过在荧光显微镜下观察细胞来检测。细胞核因染色会非常明亮,而细胞质除线粒体 DNA 之外不会被染色。

5.胃蛋白酶处理细胞。离心收集细胞并用新鲜配制的 1~2 ml 胃蛋白酶溶液悬浮,室温温育样品 5 min。

6.SYTOX Green 染细胞,方法见 Haase 和 Reed(2002)。配制 SYTOX Green 的 TE 缓冲液(pH7.5),每 2.5 ml 的 50 mmol/LTE 缓冲液中加入 1ul SYTOX Green。每份样品加入0.5 ml 的 SYTOX Green 的 TE 缓冲液,使 SYTOX Green 终浓度为 1umol/L。

来源:丁香实验

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