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    技术和方案8 酵母β-半乳糖苷酶的测定

    相关实验：酵母遗传学方法实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    有两种体外检测酵母，半乳糖苷酶的基本方法， 主要区别是所用测定材料的制备方 法不同。 第一种方法是制备粗提物并通过蛋白质定量分析进行酶活力的均一化（ Rose and Botstein 1983)。 第二种方法是利用细胞的通透性使底物进入细胞并通过测定细胞 数量进行酶力的均一化（Guarente 1983)。前一种方法适合于比较在不同条件下生长或 有不同遗传背景的细胞。后一种方法是根据大肠杆菌的检测方法改进的，特别适合于测 定单个菌株内活性水平的改变。另外，也可以通过简单的冻/融来裂解细胞，用化学发 光法检测/9■半乳糖苷酶的水平。 技术和方案8 酵母]?-半乳糖苷酶的测定 方 法 1 粗提取物测定 安全须知 硝 酸 易 挥 发 ，谨慎操作，吸入、 吞入或皮肤吸收有剧毒。应戴安全手套及防护面罩， 在化学通风橱中操作。避免吸入硝酸蒸气，远离热源、 火星、 明火。 P M S F 剧毒的胆碱酯酶抑制剂。对上呼吸道黏膜、 眼睛和皮肤有极大的损伤。若吸 入 、 吞入或经皮肤吸收，会有生命危险。应戴手套、 护目镜在化学通风橱中操作。万一 沾染了 PMSF，应立即用大量水冲洗，并丢弃被污染的衣物。 氯 仿 有 强 挥 发 性 ，对皮肤、 眼睛、 黏膜和上呼吸道有强烈刺激，必须在通风橱中使 用 ，应戴上手套和护目镜。氯仿致癌，并可损伤肝、 肾。 1 ) 在适当温度下（ 通 常 30°C)，在 5m l适当的培养基中将细胞培养到浓度为1X 107〜 2X 107 个/m l。如果是在自主复制质粒上表达杂合基因，可使用一种适当培养基对 存在质粒的菌株进行筛选。 2 ) 在冰上冷却细胞，离 心 收 集 （ 用医用离心机以2000r/m in离 心 5min)。 注意： 从这一步骤开始，其后所有步骤保持在冰上操作。 3 ) 弃上清液，重悬细胞于250ju l裂解缓冲液中，然后置一20°C冻结，以备后续测定。 以下步骤均在1. 5m l离心管中进行。 4 ) 若细胞是冻结的，可在冰上解冻。加玻璃珠恰好到液面下，再 加 12.5^1 PMSF 母液。 5 ) 以高速振荡混合6 次 ，每 次 15s，间歇时放在冰上。 6 ) 加 入 250|u l的裂解缓冲液并混匀，用 100(^1移液器深人离心管底部抽打并吸出 液体。 7 ) 离 心 15m in 以澄清提取物。如果活性存在于颗粒部分中，则未澄清的上清液也可 用 ，而测定的混合物将在步骤8 澄清。 8 ) 测定：
    A . 加 10〜lOOjul抽提物到0. 9m l的 Z 缓冲液中，用裂解缓冲液定容至lm l。 B•将混合物在28°C水浴中保温5min。 C. 加人0.2m l邻硝基苯f D 半乳吡喃糖苷（ ONPG) 母液以启动反应。注意记录准 确时间，在 28°C下保温至混合物产生淡黄色。 D . 加 入 0.5m l碳酸钠母液终止反应，注意准确记录反应终止的时间，在 420nm波 长下测定光密度。 9 ) 采用Bradford法测定抽提物中的蛋白质浓度。 A . 将 Bradford试齐Ij用蒸馈水稀释5 倍 。用 Whatman 540号 （ 或类似型号）滤纸过 滤稀释试剂。用这种方法制备的抽提物通常含有〇.5〜1. 0 m g/ml蛋白质。 B . 加 10〜20^1抽提物到lm l稀释试剂中混匀。在 595nm波长下测定形成的蓝色溶 液 ，用一次性塑料比色杯以免形成的蓝膜影响测定结果。 C . 用裂解缓冲液溶解并稀释一系列不同浓度的BSA ( 0 .1 〜lm g /m l)制成标准 曲线。 1 0 ) 根据公式计算抽提物的特异活性： _____________〇 D420X 1. 7_____________ 0. 0045 X 蛋白质浓度X 抽提物体积X 时间 式中，〇 D42Q 是产物邻硝基苯酚在波长420nm 下的光密度； 系 数 1.7是反应体积的修正 值 ； 系数0.0045是 lnm ol/m l邻硝基苯酚溶液的光密度；蛋白质浓度用mg/m l表示； 抽提物体积用m l表示；时间用m in 表示；特异性酶活力用nmol/ (min • m g蛋白质） 表^K 。 方 法 2 通透细胞测定法 1 ) 按上述方法培养细胞，测定培养物的〇 D6QQ，当培养物细胞密度达1X 106〜1X 107 个/m l时，同方法1 离心收集细胞。 2 ) 弃上清液，将细胞悬浮于lm l Z 缓冲液中。 3 ) 加 人 3 滴氯仿和2 滴 0.1% SD S， 高速振荡10s。 4 ) 在 28°C下预保温样品5m in，同方法1 加 入 0. 2ml ONPG启动反应。 5 ) 当试管中的样品变为浅黄色时，加 入 0.5m l碳酸钠母液终止反应。注意在测定时所 花的时间。离 心 l 〇mm，弃细胞碎片和沉淀物。 6 ) 测定反应物的OD420。 7) •半乳糖苷酶的活性单位为： ____________ OD420____________ 培养物的〇 D_ X 测定体积X _ 式中，〇 D42Q 是产物邻硝基苯酚的光密度；〇 D_ 是培养物的光密度；测定体积是指测定 时所用培养物体积量，用 m l表示；时间用m in表示。 材料和溶液
    裂解缓冲液 100m m ol/L Tris-HCl (pH 8) lm m ol/L 二硫苏糖醇 20% 甘油 玻璃珠 来 自 不 同 供 应 商 （ 如 Sigma, Ameirican QUALEX，Midwest Seientific， Stratagene) 直径0.45〜0.5m m 的玻璃珠都是可用的。用硝酸浸泡玻璃珠使其洁净，后用大量 蒸馏水清洗，玻璃珠用前须干燥。 PMSF (Sigma P7626)母液 用无水异丙醇（1 0 0 % ) 制备成40mmol/L 溶液，保存在一20°C条件下。 Z 缓 冲 液 （M iller 1972) 16. lg Na2HP0 4 • 7H20 5. 5g NaH2P〇 4 • H20 0.75g KC1 0. 246g MgS0 4 • 7H20 2. 7ml 片巯基乙醇 用蒸馏水定容至1L 调 p H 至 7.0,保存于4°C ONPG (邻硝基苯女1>吡喃半乳糖苷）储存液 用 Z 缓冲液制备成4mg/m l溶液，保存于一20°C Na2C0 3 储存液 用蒸馏水制备成lm 〇l/L Na2C0 3 溶液 Bradford 试齐[J (Bio-Rad) 蒸馏水 Whatman 540型滤纸或类似型号 一次性塑料比色杯 用裂解缓冲液制备〇.1〜lm g/m l牛血清白蛋白溶液 氯仿 0. 1%SDS 方 法 3 冻融化学发光法检测，半乳糖苷酶 该方法是用一种化学发光底物作为，半 乳 糖 苷 酶 的 底 物 （ 由 Applied Biosystems for Tropnc销售）。细胞必须先裂解，以便底物与/?_半乳糖苷酶相遇。该冻融的步骤简 单并适用于突光素酶分析。 适用于微量离心管的程序 1 ) 细胞培养过夜到饱和状态（ 约1〇8 个/m l)
    2 ) 稀释细胞50倍 ，让其再生长6h。 3 ) 转 移 lm l菌液到微量离心管，离心弃上清。 4 ) 在液氮中冻2min。 5 ) 在室温水浴中融化2m iri。 6 ) 再重复一次该冻融步骤。 7) 100^1 Z 缓冲液重悬细胞（ Z 缓冲液购自T ro p ix的 Galacto-Star系统）。 8 ) 加2〇 4的裂解细胞到10(^1的矛半乳糖苷酶底物和T ropix缓冲液中。 9 ) 等 待 60m in后用荧光光度计检测样品。 适 用 于 9 6 孔板的程序 1 ) 在 96孔 深 孔 板 （2ml) 中，用 〇 .6m l培养基培养细胞过夜到饱和状态。 2 ) 稀释细胞50倍到标准的96孔板，再生长6h。 3 ) 将板离心，并将板倒置在纸巾上以除去上清。 4 ) 将板在一80°C放 置 lh (若要稳定则至少放置2 天）。 5 ) 融化板，每孔加人IOO/ lJ Z 缓 冲 液 （ 购 自 T ro p ix的 Galacto-Star系统）。 6 ) 加 10(^1俨半乳糖苷酶底物和Tropnc缓冲液到白色、 不透明的96孔板中。 7 ) 转 接 20^1细胞提取物（ 包含有底物）到白显色板。 8 ) 等 待 60m in后 于 96孔荧光光度计中测定。 材料和溶液 Applied Biosystems for T ropix公司销售各种用于分析；9■半乳糖苷酶的化学发光试 剂盒。其中，Tropix Gal-Screen系 统 （ 商品目录号GSY200和 GSY1000)适用于酵母

    来源：丁香实验

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