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技术和方案5 TAP纯化方法

相关实验:酵母遗传学方法实验

最新修订时间:

材料与仪器

NP-40缓冲液 TEV C 缓冲溶液 钙调蛋白结合缓冲液(CBB) 钙调蛋白洗脱缓冲液(CEB)

步骤

1.培养 3~6L 细胞至浓度为 2X107~3X107 个/ml(OD50=1.0~1.3)。

2.离心收集细胞,并用冰预冷的水洗一次。

3.用冰预冷的 NP-40 缓冲液再洗一次后,转移到 50 ml 的离心管中。

4.离心收集细胞,用 10 ml NP-40 缓冲液重新悬浮细胞。

5.向干冰预冷的研磨杵和臼中加入液氮。在液氮挥发时,逐滴往磨臼内加入细胞。并注意添加液氮以保持细胞的冷冻状态。用力碾磨细胞 15 min。注意防止细胞的融化。

6.转移处理好的裂解物到冰预冷的烧杯,并让其在室温中融化。当边缘开始融化时,加人 20 ml 含有蛋白酶抑制剂的 NP-40 缓冲液(通常混合使用几种商业化的蛋白酶抑制剂)。

7.转移预处理好的裂解液到 40 ml 的 Nalgene 离心管中,用 SA-600 或类似型号的转头在 16500r/min 高速离心。

8.加入 1ml 琼脂糖 6B(Sigma) 的珠子(与 NP-40 缓冲液按 1:1 混合)。4°C 旋转摇动 30 mm。离心收集珠子。转移上清液到一个新的 50 mlFalcon 离心管。

9.加入 400ul 用 NP-40 缓冲液预洗过的琼脂糖 6Fast Flow IgG(Amersham),并在 4°C 旋转摇动至少 2 h。

10.旋转摇动好的产物倒人 Poly-Prep(BioRad) 层析柱。自然重力压紧。

11.30 ml NP-40 缓冲液洗柱子一次。

12.10 ml TEVC 缓冲液再洗一次。

13.将层析柱装回收集管中,加人 lmlTEVC 缓冲液和 5 叫 TEV(tobaccoetchvirus) 蛋白酶。拧紧盖后,4°C 旋转摇动 2 h 至过夜。

14.吸取洗脱液并转移到一个封住底部的新层析柱中。

15.1.0 ml TEVC 缓冲液洗旧层析柱。

16.加 3 ml CBB(钙调蛋白结合缓冲液)到 TEV 上清液中,再在每毫升 TEV 洗脱液中加人 3ul 1 mol/L CaCl2。加 300jul 雀丐调蛋白结合珠子(Amersham) 于 CBB 中,珠子与缓冲液 1:1 混合后,4°C 平摇孵育 lh。

17.洗涤:

A.1ml CBB(0.1%NP-40) 洗 2 次

B.1ml CBB(0.02%NP-40) 洗 1 次

18.堵住层析柱底部,加入 1ml CEB(钙调蛋白洗脱缓冲液)。

19.收集第一部分 1ml 洗脱液到微量离心管中。

20.堵住层析柱底部,加人 lmlCEB。

21.收集第二部分 lml 洗脱液到微量离心管中。

22.合并两次收集液,分装成 50(VU750|ul,750/zl 三份到未硅化的微量离心管中。

23.用 100%TCA 溶液配制 25%TCA,冰浴 30 mm,间或振荡。

24.用最大转速(13000r/min),4°C 离心 30 min。

25.用冰冷(一 20°C) 丙酮(含 0.05mol/L HCl) 洗一次后,在 4°C 下,最大转速离心、5 min。

26.用冰冷(一 20°C) 丙酮洗一次后,在 4°C 下,最大转速离心 5 min。

27.除去上清,真空干燥约 lOmin。

用 500ul 部分做 10% 的胶电泳银染。用 750ul 部分做质谱分析。

来源:丁香实验

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