材料与仪器
羟胺溶液 氯化铯纯化的质粒DNA NaCl 牛血清白蛋白 无水乙醇 TE 缓冲液
步骤
1.临用之前制备羟胺溶液，置冰上待用。
2.将用 CsCl 纯化的 10 埤质粒 DNA 加到含 500ul 羟胺溶液的微量离心管中。
3.在 37°C 下温育 20 h。
4.加人 10ul 的 5mol/L NaCl，50 ul 1mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA) 和 1ml 无水乙醇以终止反应，置 -70°C 10 min 以沉淀 DNA。
5.离心 10min，小心倾其所有上清液。
6.重悬 DNA 于 100ul TE 缓冲液（pH8) 中，再加人 10ul 3mol/L 的乙酸钠和 250ul 的无水乙醇，在 -70°C 下放置 10min，重复步骤 5。
7.让沉淀自然干燥，重悬于 100ul TE 缓冲液（pH8)。
8.该 DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。相对于非诱变 DNA，已诱变 DNA 在酵母中的转化效率降低了 3/4。Ura-质粒在大肠杆菌中可被检出。大肠杆菌菌株可以是 wng+，但其转化效率将降低至原来的 1/10~1/100。当转化大肠杆菌菌株（DB6507) 时，如果 URA3 基因约占整个质粒 DNA 的 10%，有望获得约 4% 的 Ura-菌落。用同样的诱变 DNA 母液转化酵母，将得到约 1% 丧失功能的突变 (敲除）。约有 10% 的突变体是温度敏感型的。
2.将用 CsCl 纯化的 10 埤质粒 DNA 加到含 500ul 羟胺溶液的微量离心管中。
3.在 37°C 下温育 20 h。
4.加人 10ul 的 5mol/L NaCl，50 ul 1mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA) 和 1ml 无水乙醇以终止反应，置 -70°C 10 min 以沉淀 DNA。
5.离心 10min，小心倾其所有上清液。
6.重悬 DNA 于 100ul TE 缓冲液（pH8) 中，再加人 10ul 3mol/L 的乙酸钠和 250ul 的无水乙醇，在 -70°C 下放置 10min，重复步骤 5。
7.让沉淀自然干燥，重悬于 100ul TE 缓冲液（pH8)。
8.该 DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。相对于非诱变 DNA，已诱变 DNA 在酵母中的转化效率降低了 3/4。Ura-质粒在大肠杆菌中可被检出。大肠杆菌菌株可以是 wng+，但其转化效率将降低至原来的 1/10~1/100。当转化大肠杆菌菌株（DB6507) 时，如果 URA3 基因约占整个质粒 DNA 的 10%，有望获得约 4% 的 Ura-菌落。用同样的诱变 DNA 母液转化酵母，将得到约 1% 丧失功能的突变 (敲除）。约有 10% 的突变体是温度敏感型的。
来源：丁香实验
