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质粒DNA的羟基突变

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1. 临用之前制备羟胺溶液,置冰上待用。

2. 将用氯化铯纯化的 10 μ g 质粒 DNA 加到含 500 μ l 羟胺溶液的微型离心管。

3. 37 ℃下培养 20 小时。

4. 加入 10 μ l 5mol/L NaCl 50 μ g 1mg/ml 的牛血清蛋白( BSA )和 1ml 无水乙醇终止反应,置- 70 ℃沉淀 DNA10 分钟。

5. 离心 10 分钟,小心弃去所有上清液,收集 DNA

6. DNA 悬浮于 100 μ l TE 缓冲液( pH8 )中,再加入 10 μ l 3mol/L 的醋酸钠和 250 μ l 的无水乙醇,在- 70 ℃下放置 10 分钟,重复步骤 5 ,收集 DNA

7. 让沉淀自然干燥,再悬浮于 100 μ l TE 缓冲液( pH8 )。

8. DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。诱变 DNA 与非诱变 DNA 相比,酵母的转化频率相对降低约 3 倍。在大肠杆菌中, Ura 质粒可被检出。

 

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