质粒DNA的羟基突变
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1. 临用之前制备羟胺溶液,置冰上待用。
2. 将用氯化铯纯化的 10 μ g 质粒 DNA 加到含 500 μ l 羟胺溶液的微型离心管。
3. 在 37 ℃下培养 20 小时。
4. 加入 10 μ l 的 5mol/L NaCl 、 50 μ g 1mg/ml 的牛血清蛋白( BSA )和 1ml 无水乙醇终止反应,置- 70 ℃沉淀 DNA10 分钟。
5. 离心 10 分钟,小心弃去所有上清液,收集 DNA 。
6. 将 DNA 悬浮于 100 μ l TE 缓冲液( pH8 )中,再加入 10 μ l 3mol/L 的醋酸钠和 250 μ l 的无水乙醇,在- 70 ℃下放置 10 分钟,重复步骤 5 ,收集 DNA 。
7. 让沉淀自然干燥,再悬浮于 100 μ l TE 缓冲液( pH8 )。
8. 该 DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。诱变 DNA 与非诱变 DNA 相比,酵母的转化频率相对降低约 3 倍。在大肠杆菌中, Ura - 质粒可被检出。