原理
限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
材料与仪器
标准pUC19（2686bp）
EcoRI及其配套的酶切缓冲液 0.5×TBE电泳缓冲液 6×Loading Buffer Goldview 琼脂糖
水平电泳仪 水浴锅 移液器 微波炉 成像设备
EcoRI及其配套的酶切缓冲液 0.5×TBE电泳缓冲液 6×Loading Buffer Goldview 琼脂糖
水平电泳仪 水浴锅 移液器 微波炉 成像设备
步骤
1.在200ul的离心管中，按照下表加入试剂（单位：ul），混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃保温2h进行酶切反应。
2.反应结束后，加入2ul 10x Loading Buffer钝化酶活性；（或：65℃，保温20min使酶失活）。
3.电泳检测。
酶切阴性对照：pUC19标样+10x Loading Buffer 2ul
酶切样品：标准pUC19酶切样品10ul + 10x Loading Buffer 2ul
4.质粒及酶切样品电泳预期结果。
2.反应结束后，加入2ul 10x Loading Buffer钝化酶活性；（或：65℃，保温20min使酶失活）。
3.电泳检测。
酶切阴性对照：pUC19标样+10x Loading Buffer 2ul
酶切样品：标准pUC19酶切样品10ul + 10x Loading Buffer 2ul
4.质粒及酶切样品电泳预期结果。
注意事项
影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切（星号活性）。
常见问题
可以采用无缝克隆作为替代方案进行基因重组。
来源：丁香实验
