🔥 质粒 DNA 酶切

限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链 DNA。

pUC19 载体（2686 bp）

EcoR I 及其配套的酶切缓冲液

0.5×TBE 电泳缓冲液、6×Loading Buffer

Goldview、琼脂糖水平电泳仪、水浴锅

移液器、微波炉、成像设备

1、在 200 μl 的离心管中，加入以下试剂：

混匀后，点动离心将反应液甩至管底。37 ℃ 保温 2 h 进行酶切反应。

2、反应结束后，加入2 μl 10×Loading Buffer 钝化酶活性（或 65 ℃，保温 20 min 使酶失活）。

3、电泳检测。酶切阴性对照：pUC19 载体+10×Loading Buffer 2 μl；酶切样品：pUC19 载体酶切样品 10 μl + 10×Loading Buffer 2 μl。

影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA 的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg²⁺ 等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切（星号活性）。

可以采用无缝克隆作为替代方案进行基因重组。