dxy_ymfnles8
各位大佬救救孩子吧,请问有做过构建gfp-kferq质粒的吗,找公司合成的菌,但是一共做了四十几次提质粒了,每次浓度都巨低只有200ng/ul 和空载一起提的 ,空载每次都有400ng/ul 。转染之后wb鉴定没有目的基因表达 ,并且质粒梅切鉴定几十次了,每次酶切都没有条带, 开始以为不能冻,结果现切现跑也没有条带,并且把酶量减少到0.5ul ,酶切时间缩短到30分钟也没有条带,琼脂糖凝胶电泳的样品点样一次是marker、空载、合成质粒、marker、合成质粒、酶切,有次一下提了六个质粒同时酶切然后跑胶也没有任何条带。选的是ageI和ecolr1酶。请问是这个菌有问题吗
z流沙z
质粒浓度低,而且酶切没有条带,这基本上质粒是有问题的,可以把质粒或者菌液拿去测序或者pcr鉴定一下
sswei
质粒酶切一直没有条带了,可能酶切位点发生了突变,也可能是酶失活了。
loveliufudan
您的问题可能有以下几个原因:
1.质粒提取不完全或质量不佳,导致浓度低或有杂质干扰。建议您检查质粒提取的步骤和条件,测量质粒的浓度和纯度,或者重新提取质粒。
2.酶切位点有问题,导致切不开或切错位置。建议您检查质粒的序列和酶切位点,确认酶切位点是否存在或是否正确,或者换用其他酶切位点。
3.酶或酶切体系有问题,导致酶切效率低或没有酶切反应。建议您检查酶的活性和保存条件,选择合适的酶切缓冲液和温度,调整酶和质粒的比例和反应时间,或者换用新的酶。
4.电泳条件有问题,导致条带不清晰或不可见。建议您检查电泳仪器和电源是否正常,选择合适的琼脂糖浓度和电压,调整上样量和电泳时间,或者换用新的染料和显影方法。
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