一直错到底的 Western 步骤分享

2016 年 3 月份，一只挂着博士头衔的菜鸟走进了实验室。因实验需要，第一步就是做 Western。菜鸟知道，网上 Western 错误步骤分享特别多，但从菜鸟的经历来说，网上的错误还没有错到底，因为菜鸟错的地方，别人没错过 。所以在这里献上一篇关于一只菜鸟如何将 Western 操作错到底的经验分享。

菜鸟师姐遇上伶俐师妹的场景再现：

于是，长达 8 个月的 Western 学习就开始了。

Western 基本步骤不多说了，这里只说我是如何将伶俐的淑女师妹和自己推向绝望的深渊......

☞ 错误一：忘记蛋白定量

第一次提取我们需要的细胞后，我们直接加入 loading buffer，加多少呢？按照「祖上」传下来的秘方加入。

结局：压根还没做到结局就在另一个步骤上夭折了。

经验总结：蛋白定量是为了保证结果的可靠性，但是否有必要定量还是取决于实验的目的。

比如，如果不能够定量，而跑道加样量相同，结果可能一粗一细，则无法根据一粗一细两条带来证明粗条带的样品目的蛋白质表达水平较细条带样品高。当然，如果你的内参显示出一样均匀的条带，则可以解决这个问题。但是如果总蛋白不定量，内参均匀纯粹是个碰运气一样的事。

☞ 错误二：蛋白定量结果浓度过高，超出标准范围

第二次，在说明书、各类实验网站（感谢各大科研网站）以及一位热心大师姐的指导下完成了蛋白定量的操作，但遗憾的是，浓度超出了标准范围，因为提取的细胞总量不够所以也没有设立复孔。

第三次，我们将提取的细胞设立了 A、B 两个复孔，A 孔不稀释，B 孔稀释一倍，如果采用 B 孔数据我们直接将结果乘以 2 即可。

经验总结：在没有经验的情况下，多弄一个复孔，多给自己留一点余地，是很有必要的。

☞ 错误三：分离胶浓度配置错误

此处，怪菜鸟做实验之前没有备好功课，淑女当时已到达崩溃边缘，菜鸟还在硬撑。菜鸟和淑女不知分离胶浓度与蛋白分子量密切相关，自信满满配胶完毕后，实验室的各位大神开始出现，抛来一堆问题，比如：「你们蛋白分子量多少啊？」「分离胶浓度呢？」一问三不知，于是，一切重新开始……

经验总结：备好功课再动手。

☞ 错误四：漏胶

两玻璃板下端没有对齐。此次失误，纯属心乱神麻。

经验总结：做实验一定要心静，不要被之前的错误吓到或者扰乱。

☞ 错误五：制胶玻璃板放入架子时正反面放错

正确操作：制胶玻璃板是一块长板一块短板，合在一起进行配胶，配胶完毕后将其放入电泳专用架子中，应短板向里，长板向外。

错误演示：菜鸟带着淑女将短板朝外长板朝里，使劲塞入架子中。

结局：电泳槽通电后，电泳架子内的导丝没有冒泡泡。立即询问热心人士，发现正反面放置错误，取出后玻璃板已碎成两半。

经验总结：细节决定成败。

☞ 错误六：转膜前错用 TBST 洗膜液浸泡 PVDF 膜

正确操作：将 PVDF 膜放入甲醇中浸泡。

错误演示：前几次，此步骤都是淑女师妹操作，操作正确规范，这次菜鸟师姐自己上手，将 PVDF 膜放入了配好的 8.3% 浓盐酸的 TBST 中浸泡了 10 分钟。（师姐当时想的是 TBST 是洗膜液，就可以用来浸泡 PVDF 膜）

结局：由于浓盐酸的腐蚀性，再加转膜时的高热反应，导致 PVDF 膜部分腐烂。

经验总结：请照着说明书做，不要凭空想象，操作前要仔细核对，做好每一步的笔记。

2016 年 5 月初，第六次失误出现后，实验室鸦雀无声。（沉默有的时候是因为内心的崩溃却不能发泄）

☞ 错误七：转膜前，将分离胶上的正反面放错

正确操作：电泳后，取出玻璃板，切胶时手持长玻璃板，轻轻揭开短玻璃板，此时正面朝上，背面朝下（我将有蛋白分子的一面称为正面，靠近长玻璃板的一面称为背面），用切胶板将胶慢慢取出，直接放在转膜滤纸上，正面朝上，再用浸泡后的 PVDF 膜盖在胶的正面，赶出气泡。

错误演示：菜鸟师姐手握短板，揭开长板，背面朝上，正面朝下……

结局：蛋白全部跑出，结果一片空白。

从 3 月份到 11 月份，曝光结果完全一致：空白，无任何条带。菜鸟师姐和淑女师妹曾一度怀疑：

1.操作问题：但菜鸟师姐在经历 N 次失败后，替师兄做了一次 Western，结果超乎想象的完美，所以操作问题排除。

2.抗体问题：菜鸟师姐的一抗全是 CST 进口，但仍执意将将样本发到厂家，厂家用我返回的抗体和样本做出了条带；二抗国产，换了两次二抗，还借用师兄师姐的二抗多次，一样是空白结果，所以排除一抗二抗的问题。

3.配胶浓度问题：换了好几种分离胶浓度，仍无条带。

4.孵育时间问题：一开始一抗过夜，二抗 2 小时孵育，最后改为一抗过夜，后再平遥一小时，二抗过夜，结果仍无条带。

5.样本问题：将样本送到师兄和厂家那里能做出结果，师兄的样本借我后，仍做不出结果，排除样本问题。

6.TBST 洗膜液浓度问题：借用师兄的洗膜液配置牛奶和洗膜，仍无条带。

7.运气问题：为了驱赶不好的运气，菜鸟师姐和淑女师妹回家呆了半个多月，求神祈福，查找各种 Western 贴吧，待心情好转，返回实验室，重新开始的结果仍无条带。

8.命的问题：各位诸神不让我出结果，我何必强求呢？再次返回宿舍梳理实验，学习传统武术赶走不良情绪，等待诸神召回。

2016 年的 11 月，天气转寒，淑女师妹再次进入实验室进行 Western 操作，发现配胶后分离胶需要一上午的时间才能凝，浓缩胶最短时间则需要两多小时。赶紧询问热心大师姐，答案是：「哎哟，凝胶试剂都已经过期一年多了啦」。

☞ 错误八：试剂过期

如上所述，菜鸟师姐将所有的抗体、样本、运气都考虑了一遍，结果忘了最重要的也是最便宜的试剂，凝胶试剂盒。

凝胶作用：聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。所以凝胶试剂过期，失去作用，不会显示条带。

经验总结：在做实验之前，弄清所需试剂，并查看试剂的日期，尽量不要用过期试剂，以免影响实验结果。

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更换凝胶试剂盒之后，蛋白条带清晰的出现在菜鸟与淑女的面前，历经 8 个月……

以上错误虽小，但为了让广大菜鸟避免犯同样的错误，撰写此篇，望对实验菜鸟们有所帮助。

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