合作专家 | 孙齐博士
生理学 首都医科大学
简介
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
原理
与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显色」用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
材料与仪器
【试剂】
PBS、RIPA 裂解液、ddH2O、loading buffer、甲醇、抗体等；
【器材】
EP管、PVDF 膜、-20℃ 低温冰箱、匀浆器、高速离心机、电泳转移装置；
步骤
一、蛋白样品准备：
1、以 6 孔板为例，先吸尽培养基，1xPBS 漂洗一下残留培养基（手动轻轻晃几下即可）后，加入预先配置好的含有终浓度 1mM PMSF/PI（检测磷酸化，可以加入 Na3VO4，NaF）的 RIPA 裂解液 500ul（RIPA 相对温和，适合 Co-IP；对于一般 WB 裂解，或对膜/核蛋白 WB，可以加入含有去垢剂 0.1% SDS 和脱氧胆酸钠的细胞裂解液，增加裂解效果）。
2、加好后用细胞刮（或枪头吹打）将细胞刮离孔底，吸回细胞裂解物至 EP 管中，4℃ 裂解 0.5-3 hour，可置于冰箱内旋转机器上使样品充分混匀裂解；
裂解完成后，12000rpm 4℃ 离心 10min，吸回上清，在吸回的上清中加入等体积的 2X loading（或 4X）并混匀，再将样品于 95℃ 变性 15min，变性结束后，样品可用于 SDS-PAGE 电泳。样品冻存于 -20℃ 或 -80℃。
3、制备组织样品时，按 0.1g 组织用 1ml 裂解液的比例在匀浆器中对组织进行研磨裂解，研磨充分后，将匀浆液吸至 EP 管中，至于冰箱内旋转机器上使样品充分混匀裂解 0.5-3 hour；
裂解完成后，12000rpm 4℃ 离心 10min，吸回上清，后续处理方法同细胞样品。
二、制胶及电泳：
用于制胶的玻璃板注意使用前清洗干净并晾干；注意玻璃板与胶接触的一面是否有划痕，尤其是下边缘破损，划痕可能导致电泳过程中出现漏样。
1、胶的配方：
配置合适浓度的分离胶，在胶板下层注入分离胶后，向胶板内轻轻注入 ddH2O 或异丙醇起到液封的作用，促进分离胶凝固；约 20min 分离胶即可凝固，可以倾去用于液封的 ddH2O，并倾斜放置胶板一会，让残余的 ddH2O 汇聚到一起后方便用滤纸吸尽；将胶板放平后继续配置浓缩胶，将浓缩胶注入胶板中，至薄玻璃板的上缘即可，尽量不要产生气泡，然后轻轻插入梳子即可；胶约 20min 后即可凝固使用。
2、电泳缓冲液为 Tris-Glycine-0.1%SDS 缓冲液。小分子蛋白（<15kD），建议用 Tris-Tricine，可以让条带压得更细。
3、100V 电泳，并根据实验需求及时终止电泳。一般浓缩胶电流小于分离胶电流。
提前配置转膜缓冲液并预冷备用（赶跑气泡）。转膜缓冲液为含有20%（v/v）甲醇（或等体积乙醇）的Tris-glycine溶液。
三、转膜：
1、先从胶板中将胶取出，根据具体实验需要确定是否取出浓缩胶部分，将胶在转膜缓冲液中浸泡 10min；裁剪与胶大小一致的 PVDF 膜和滤纸（统一：PVDF 膜 5.5X8.5 cm，滤纸 7X9 cm），PVDF 膜先用甲醇浸润 1min，再转入转膜缓冲液中浸泡 10min；
2、转膜时，转膜用的夹子黑色面在下，然后依次放：转膜用海绵垫，湿润的三层薄滤纸，蛋白胶，PVDF 膜，湿润的三层薄滤纸，转膜用的海绵垫；在放 PVDF 膜之前，先在蛋白胶上加少量的转膜缓冲液，放膜时将膜的一侧边缘与胶对齐后，膜会被溶液慢慢吸到胶上去，这样可以避免产生气泡；然后将夹子夹紧后放置到转膜槽内，注意夹子的黑色面要靠近转膜槽的黑色面，转膜槽电源接头处的颜色要与外面塑料槽标记的颜色匹配，防止正负电极搞错。
如果使用 NC 膜，则略去用甲醇浸泡的步骤，其余步骤不变。
3、转膜条件：100V，2h，冰浴（大分子蛋白可以增加到 3h）。
4、转膜完成后，可使用丽春红对膜进行染色，确定转膜是否成功。
四、封闭及抗体孵育：
1、封闭使用含有 5% 脱脂奶粉的 1xTBS（pH7.4），室温 1h，于摇床上进行；一抗孵育在 4℃ 冰箱的摇床上进行，孵育过夜，抗体稀释于含有 2% 脱脂奶粉的 0.1% Tween/TBS（pH7.4）中（为防止回收抗体变质，孵育前需添加 0.02% 的 NaN3）。孵育结束后，回收一抗储存于 4℃；用 1xTBST (0.1%Tween/TBS) 洗膜，10min/次，共洗 3 次。
2、二抗稀释（1:5000）于含有 2% 脱脂奶粉的(0.1%Tween/TBS)（pH7.4）中（HRP二抗不能添加 NaN3），于摇床上室温孵育 1h；孵育完成后，用 1xTBST 洗膜，10min/次，共洗 3 次。
五、显色及压片：
1、在干净的塑料膜上加适量的显色底物，然后将膜正面对着底物，让膜贴上去，室温静置 1-2min 后可到暗室压片；压片时需要根据荧光强弱选择适当的曝光时间。初学者起始 1min，然后根据黑暗中是否看到荧光，直接压 >5min 或快速几秒。以曝光时间 30s 为例，将膜正面（右上角折角作为记号）向上至于压片盒中，将 x 光片放到膜上，关紧压片盒，计时 30s，然后打开压片盒取出 x 光片，先在显影液中浸润 1min 后再在 ddH2O 中漂洗 10s，最后在定影液中浸润 1min 即可。可根据 X 光片上的条带强弱情况，具体再选择合适的曝光时间。为了充分利用胶片，建议把膜不要放正中间，这样可以一张胶片压多个时间点。
2、对荧光强度特别强的膜，可以把膜翻过来，从膜背面压片。或快速用手按紧胶片即刻拿走冲片。或同时压两张胶片。或等待一段时间再压片。新手不建议一次检测多张膜。
原则: 强信号和弱信号兼顾。
3、对荧光强度特别弱的膜，可以使用超级灵敏底物，动作紧凑，不要浪费信号。
4、压片完成后，及时标记 marker，做好记录，并且保持 PVDF 湿润，可以在 TBS 中 4℃ 暂时保存。
六、Reprobe：
压片完成后，需要对膜重新进行别的抗体的检测时，先用 1xTBST 洗膜 10min，在合适的容器内用 strip buffer 处理 20min，最后用 1xTBS 再洗 10min，膜即可进行重新的封闭及抗体孵育。
注意事项
常用 buffer 配制：
1）Cell Lysis Buffer:
150 mMNaCl
10 mM EDTA
1% Triton X-100
0.1% SDS
1% Na-deoxycholate
PIC/0.25 mM PMSF
in 50 mMTris-HCl pH 8.0
检测磷酸化：可以添加 Na3VO4: 1 mM ; NaF: 1 mM 或磷酸酶抑制剂 Cocktail
2）SDS-PAGE stock solution
(1) Monomer Solution (30%T 2.7%CBis)(4℃)
Acrylamide 58.4 g
Bis 1.6 g
d2H2O to 200 ml
(2) Separating Gel Buffer (1.5M Tris-HCl pH 8.8)
Tris 36.3 g
d2H2O to 200 ml
(3) Stacking Gel Buffer (0.5M Tris-HCl pH 6.8)
Tris 3 g
d2H2O to 50 ml
(4)Samle Buffer
Tris-HCl pH6.8 (Solution(3)) 0.25ml
SDS(Solution(4)) 0.4 ml
Glycerol 0.2 ml
2-mercaptoethanol 0.1 ml
40mg/ml BPB 0.05ml
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total: 1 ml
(5) 10x Running buffer pH 8.3
Tris 30 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
d2H2O to 1000 ml
（6）Transfer Buffer (25mM Tris, 192mM Glycine, pH 8.3 ):
Tris 3.03 g
Gly 14.4 g
甲醇或乙醇 200 ml
add d2H2O to 1000ml
（7）Ponceau S solution (0.5% Ponceau S dissolved in 2.5% HOAc) .
e.g. 50ml : 0.25g Ponceau S / 1.25 ml HOAc / 48.75 ml d2H2O)
（8）温和型 Strip buffer (100 ml):
1.5g Glycine/0.1g SDS/1ml Tween-20 in 100 ml H2O, PH2.2,常温反应
剧烈型 strip buffer(100ml):
687ul 2-ME/20ml 10%SDS/12.5ml Buffer3 (stacking buffer)，50C 反应
常见问题
Western blot 实验常见的问题：
（1）参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow，david lane）两本书不错。
（2）针对样品的常见问题
A. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120 μg，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
B. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？
解答：一般地 5 × 106 就足够了。
C. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。
D. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
E. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。
F. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加 5~10％ 甲醇。
G. 想分离的蛋白是分子量 260 kDa 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作 Western Blot 吗？
解答：260 kDa 的蛋白不好做，分离胶用 6％，Stacking Gel 3.5％。
H. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载 30％ 是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5 mm 的 comb。
I. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：-80 ℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉 (也是被酶水解了)。
J. 我所测定的蛋白分子量是 105 kDa，按理说分离胶应当采用 7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用 11％ 的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为 105 kDa 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
K. 接下来我准备采用 DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用 5％ 的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用 BSA 代替应该好一点。
L. 一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot 一般上样 30~100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳 性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
M. 做组织样品的 western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比 BSA 好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入 ＰＭＳＦ 和蛋白酶抑制剂 cocktail），封闭剂一般 5% 脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用 BSA 也是不错的选择。
N. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白 200 kDa，在做 western 要注意什么呢？
解答：做 200 kDa 蛋白的 Western Blot 时要注意，分离胶最好选择 7% 的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
O. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
P. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为 42 kDa 的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42 kDa 的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用 RIPAbuffer 提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做 Western Blot 就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42 kDa 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
Q. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了， 但是不要超过 0.3 μg/mm2。
R. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
S. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗。
T. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的 ELL+plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短 Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般 37 ℃，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1:1 500；二抗 1:20 000 试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是 5 × 5 min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
U. 免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
V. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 2~3 次。稀释后应在 2~3 天内使用，4 ℃ 保存，避免反复冻融。
来源：丁香实验
