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蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

实验分类:

蛋白质实验

最新修订时间:

简介

蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

原理

Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,「探针」是抗体,「显色」用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

应用

(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

来源:丁香实验

操作方法

Western印迹法

一、操作步骤: 1. 蛋白样品制备 (1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取: ① 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。 ② 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01 M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。

图解

一、实验步骤 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

蛋白质免疫印迹实验

操作流程 (1)制备与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜一张,吸水滤纸 2 张 (Whatman 3 MM)。 (2) 将凝胶在转印缓冲液中浸泡 30m in,将转移膜、滤纸和海绵垫也在同样的缓冲液浸湿。 (3) 安装转印「夹心三明治」。将凝胶放置在玻璃平板上,然后将一张浸湿的滤纸放在凝胶上,如果是米用半干转的方式进行蛋白质转印,那么宜用三张滤纸。将玻璃板翻转 ,并且将其

底物化学发光ECL法

一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M P

【模版】WB 实验大赛,我的方法分享

Western blotting 主要用于检测蛋白质,其技术流程分为蛋白质电泳分离、蛋白印迹(转膜)和免疫检测三个步骤。

【Olaf】我的 WB 经验分享,快来帮我点赞吧!

1. 准备样品1)制冰,准备冰盒。2)配制细胞裂解液:根据细胞数量确定所需裂解液:50 ul/六孔板一孔 。裂解液配方:100 ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1 ul PMSF3)按实验需要准备好细胞:去掉培养基,1×PBS洗 3 次(去掉培养基中的血清),每个孔( 6 孔板)加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至 1.5 ml管中,置于冰上 20 min,振荡混合后,再置冰

【静静菌】我的 WB 经验分享,快来帮我点赞吧!

1.分别配制 5% 浓缩胶和 12% 分离胶12% 分离胶10mL 5%积层胶 6mLH2O 3.3mL H2O 4.20mL30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mLpH8.8 Tris HCl(1.5M) 2.5mL PH6.8Tris HCl(1M) 0.76mL10%APS 100uL 10%APS 60uL10%SDS 100uL 10%SDS 60uLT

【LW】我的 WB 经验分享,快来帮我点赞吧!

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做 wb 实验时,样本如何精准上样?

1、提取时冰上操作,buffer 添加蛋白酶抑制剂;2、蛋白尽量同一批次提取、测定浓度,保存及使用情况尽量一致,防止部分样品有降解;3、蛋白提取后尽快测定浓度,添加标曲;4、最好调整为统一浓度后上样体积保持一致;5、每孔上样体积不宜过大或过少,不超过最大上样量,避免样品溢散污染;6、由于样品有一定粘滞性,枪头吸液后外壁会黏附一些,加样时需注意,使用长而细的枪头;7、相比等体积上样,如果可以,尽可能

如何使用 Photoshop (PS) 处理 Western blot 条带及组图?

使用 Photoshop(PS)处理 Western blot 条带及组图的过程:1. 打开 Western blot 图片,在 PS 中选择「文件」->「打开」并选择需要处理的 Western blot 图片文件;2. 调整图片大小和分辨率,可以使用「图像」->「图像大小」来调整 Western blot 图片的大小和分辨率,分辨率高于300 ppi;3. 调整图片对比度和亮度,使用

怎么应用 ImageJ 测量 western blot(WB)条带灰度值?

① 选择「文件」->「打开」打开要计算灰度的 wb 结果图;② 使用「矩形选定工具」选定有条带的区域,然后选择「Edit」->「Selection」->「Make Band」来将选定区域定义为条带,框起其中一个结果,按 ctrl+1;(注:矩形框的长要小于宽的两倍)③ 把框移动到下一个结果,按 ctrl+2;④ 重复步骤 ③,一直到所有的结果都选上;⑤按 ctrl+3 进行计算;

如何配制出又直又好看的 wb 胶板?

1、厚薄玻璃板须洁净,干燥,夹板架固定好玻璃板,注意不要漏液,注意两块玻璃板底部保持平齐;2、分离胶和积层胶溶液必须充分混匀,加入 AP、TEMED 后迅速轻摇混匀,灌入两块玻璃板间隙中;3、用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面,阻断空气,分隔线会更加平直,待分离胶凝聚后倾斜架子,用滤纸吸干剩余的无水乙醇;4、梳子垂直插入两块玻璃板中间,注意避免梳子孔之间产生气泡,室温水平放置,待积层胶凝聚,轻轻

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