【LW】我的 WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

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应用western blot技术对蛋白进行定性和半定量分析

RIPA、PMSF、PBS、细胞刮刀、EP管、离心机、浓缩胶-分离胶、无水乙醇、移液器、电泳槽、电泳液、loading buffer、marker、切胶板、PVDF膜、湿转转膜仪器、转膜液、脱脂奶粉、摇床、一抗、二抗、显影液、定影液、发光仪器等。

（1）蛋白样品的制备：
以100：1的比例，配置RIPA:PMSF的裂解液1000微升。取要裂解细胞的培养皿，用移液枪吸去上清液，用PBS液冲洗2-3遍，加入裂解液500微升，充分混匀，冰上裂解10分钟。用细胞刮刀刮取培养皿，并用移液枪转移液体至1.5ml的EP管中，置入离心机，设置4℃、12000转，离心10分钟，取上清液（一定不要碰到下层沉淀）置入新的EP管，以上清液：loading buffer=4:1的比例，配置成适量的蛋白体系。
（2）蛋白定量：
我一般使用96孔板法测标准曲线。首先，根据标准品和样本数量，按50：1=A：B的比例配置适量的BCA工作液（一般计算2-3个平行），并充分混匀。然后将蛋白标准品按0、1、2、4、6、8、10微升加入到96孔板的蛋白标准品孔中，加双蒸水配平至10微升。取10微升的待测样品加入到96孔板。向之前加液的孔中加入200微升BCA工作液混匀。37℃热浴半个小时，冷却至室温。用酶标仪在562nm波长下测定吸光度，然后制作标准曲线并由此算出样品浓度即可。
（3）配胶：
我们一般都是自己配，按照说明书的比例即可，一般跑大蛋白就用12%的胶，小蛋白就可以选择15%的胶。这次我们选择1.0mm的玻璃板，短板对着我们，将长短板对齐固定好，加入ddd纯水验漏，如果密封良好，就可以配置下层胶。一般跑一块板配个5-7ml即可，按照说明书的比例配置好下层胶后，用移液枪吹打均匀（至少20次，不要有气泡，这个过程不要太慢），缓慢向胶板中加入下层胶，加至绿线以下即可。然后加入无水乙醇封胶，等待15-20分钟。这里有个小技巧，既等到10分钟左右的时候就可以配置上层胶了，上层胶一块板配2-3ml左右，同理配置好上层胶并吹打均匀，倒掉无水乙醇，残留的无水乙醇用滤纸吸取干净（滤纸不要碰到下层胶），缓慢均匀加入上层胶至稍微溢出胶板，赶走气泡，迅速插上梳子（梳子孔一定不能有气泡）静置10-15分钟左右。
制胶就完成了，胶板一般如果当天跑就当天用，当天不跑，加入三蒸水用保鲜膜包裹，放置4℃冰箱可以保存1周。
（4）电泳：
将玻璃板的长板对着我们，夹在电泳夹上，，在电泳夹内两个玻璃板之间倒入适量的电泳液，没过玻璃板长板即可。确定密封良好，不漏液，则可将其余电泳液倒入电泳槽至1/2即可。拔出梳子，用移液枪按照顺序在梳子孔中加入maker5微升，样品适量。盖上盖子（红对红，黑对黑），插上电极。先设置80mv，恒压跑到出marker条带，可以看到一条小红线。在把电压调节至120mv，恒压跑到条带到电泳夹下绿线处往上一点即可。
（5）切胶：
这一步需要细心仔细，一般对照maker条带，可以分辨出大蛋白和小蛋白的方向，我们的习惯是把maker放在左上方，从上到下依次是170、130、100、70、55、40、35、25、15、10大小条带，按照你要跑的蛋白大小，选择合适的区域切胶即可。切胶一定要迅速，不要让胶干了。切胶之前可以用直尺对比着量好你要用的PVDF膜的宽度，然后裁好，一定要用镊子拿取PVDF膜，千万不要用手直接拿。把裁好的PVDF膜放置甲醇中活化1-2分钟。
（6）转膜：
转膜有湿转法，半干转法，干转法，根据自己的喜好选择。我们一般是湿转和半干转用的比较多。今天介绍湿转法，首先制作转膜三明治：按照黑海绵，白海绵，滤纸的顺序制作成三明治。用转膜液充分浸泡，把切好的胶用切胶板转移到转膜夹上的黑色板的滤纸上。用夹子把PVDF膜贴到胶条上（膜和胶之间不能有气泡！）一定要注意放置的顺序，胶在黑板，膜在红板，不然就把蛋白转到滤纸上了！！！！！把转膜夹按照红对红，黑对黑的方向放置到转膜槽，加入适量的转膜液。设置180毫安，恒流运行90分钟。
（7）封闭：
我们一般使用脱脂奶粉的比较多，按照比例一般是100ml三蒸水：1.5g的脱脂奶粉去配置，充分搅拌均匀后，取上清液使用。取出转好的膜，放入盒中，倒入适量的封闭液，在摇床上摇1-2个小时。其实封闭液还有BSA（牛血清白蛋白）、PVP、鱼胶等，但是还是脱脂奶粉又便宜又好用。
（8）孵抗体：
封闭完成后，用洗膜液洗2-3次，每次10分钟。加入适量的稀释好的一抗，放入4℃冰箱过夜。
第二天，回收一抗，用洗膜液洗2-3次，每次10分钟，加入适量稀释好的二抗，室温下在摇床上缓慢摇动1-2小时。
（9）显影：
在使用之前应开机预冷，温度降至-20℃即可进行检测。将化学发光检测试剂盒中的A和B以1：1的比例混匀，将PVDF膜正面朝上放入暗箱，用移液枪吸取适量的发光液，均匀的涂布在膜上，关闭仓门，进行曝光，用电脑查看照片即可。

wb的步骤繁琐，需要注意的事项很多，在这里我选择几个重要的来叙述。
（1）首先制备蛋白样品时，离心后取上清液一定不能吸到下面的沉淀，宁可少一点，也不要吸到下面的沉淀；
（2）配胶时，一定要吹打均匀，不然跑出来的条带可能会弯弯曲曲；吹打要迅速不能用时过长，不然胶可能还没加进玻璃板就优点凝固的趋势；
（3）配胶时，要根据季节和温度来选择加入适量的AP和TEMED，这样可以让你控制它的凝固速度；
（4）把玻璃板固定在电泳夹上的时候，一定要确保其密封性良好，不会漏电泳液，不然跑一半可能电泳就停了；
（5）切胶时一定要注意计算好你要测的蛋白在胶上的大概位置，不要一刀把该区域切断了，或者直接切错了区域；
（6）切胶一定要迅速，不要让胶干了，可以加一点转膜液湿润；
（7）转膜时，一定要搞清楚，胶和膜放置的位置，不要放反了，不然你可能会发现，你转到了滤纸上，哭笑不得：
（8）封闭时，封闭液如果选择脱脂奶粉，一定要让它搅拌均匀，取上清液，不能有固体小颗粒，不然显影时会发现膜上全是点点；
（9）在封闭时，放膜，胶，滤纸一定不能有气泡，如果有可以用滚轮赶走，不然会影响显影；
（10）选择一抗和二抗时一定要观察仔细，别一抗是鼠的，二抗又孵了个抗兔的。

wb的常见问题，我就挑选几个我最开始犯的错误来说吧。
（1）问：为什么跑出来的条带呈现哑铃状？
答：出现哑铃状，可能是因为在配胶的时候没有配置好，没有吹打均匀，胶凝固后不均匀。或者是因为样品中含有太多的杂质。
（2）问：为什么会发生拖尾现象？
答：出现条带拖尾，可能是因为一抗的浓度太高，可能增加稀释倍数。洗一抗时，洗三次，每次10分钟。
（3）问：为什么显影后无条带？
答：没有条带，有可能是转膜的时候膜和胶的位置防反了，转到了滤纸上。或者是你的一抗二抗选择错误。还有可能是抗体孵的时间太短，洗的时间太长了洗掉了。
（4）问：为什么转膜后，发现膜上没有maker，转膜效率低？
答：可能是因为你的转膜液使用的次数过多，甲醇挥发导致，建议转膜液使用2-3次，浑浊了就可以更换了。
（5）问：为什么转出来的膜上目的蛋白很弱，看不清？
答：可能是你的上样量太少，或者是抗体的浓度太低。建议增加上样量，或者增加抗体的浓度。
（6）问：为什么检测出来的分子量要比说明书上的大？
答：可能是本身存在蛋白修饰，或者是抗原形成了二聚体。
（7）问：为什么跑出来的条带总是出现拖尾现象？
答：可能是你分离胶的浓度过大，或者是你的样品溶解度不好。
（8）问：为什么跑出来的条带不整齐，弯弯曲曲？
答：可能是在配胶时，没有吹打均匀，导致胶凝固是不是均匀状态，或者是胶上有小气泡。
（9）问：我配制的一抗和二抗能重复用几次，如何保存？
答：抗体一般放置在4℃冰箱保存。一般稀释好的抗体，可以使用2-3次。
（10）问：跑出来的条带上有随机分布的白色斑点？
答：在抗体孵育时，使用摇床，不然抗体分布不均匀就容易导致这种现象。