【Mosquito】我的 WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

我的 WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

beta-actin

显影仪、伯乐、电泳仪、转膜仪六一。

1、样品制备

（1）细胞收集

a. 贴壁培养细胞收集
去除贴壁细胞的培养液，用 PBS、NS 或无血清培养基清洗 1 次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
b. 悬浮培养细胞收集
速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
c. 组织样本收集
把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在 1~2min 之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

a. 细胞/组织裂解
将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1 个 T75 培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解 20 min，每隔 5 min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡 10 s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
b. 离心
把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。
c. 蛋白变性
完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

a. BCA工作液的配置
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
b. 标准品测定
取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或undefinedPBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

根据使用说明书安装。

（2）分离胶制备

根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

（3）浓缩胶制备

分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

（4）上样

待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽 Tris-Glycine SDS Running Buffer 需注满，外槽 Tris-Glycine SDS Running Buffer 没过底部 3~5cm 即可。

（5）电泳

上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压 80V，待样本进入分离胶时，可将电泳调至 120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。

3、转膜

（1）准备工作

a. 转膜缓冲液至少提前 2h （即开始电泳后）放入 -20℃ 冰箱预冷。
b. 根据胶体大小选择,将 Filter Paper 及 Nitrocellulose membrane 剪裁至合适尺寸。
c. 目的蛋白 ＞20KD 选择 0.45μm NC 膜；目的蛋白 ＜20KD 选择 0.2μm 的 NC 膜或 0.22μm 的 PVDF 膜，选择完毕后将 NC 膜放在 Western Transfer Buffe r中浸泡备用，注意如使用的是 PVDF 膜需先放入甲醇中浸泡 5-10 min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）

4、封闭

将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。

5、一抗孵育

a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。

6、洗涤

一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。

7、二抗孵育

a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。

8、洗涤

二抗孵育结束后，加入 TBST Buffer 洗涤 4 次，5 min/次。

9、曝光

见实验步骤

样品制备很关键，充分裂解细胞，可采用超声；

胶制备同样关键，充分凝固；

有条件建议采用湿转，较半干转可控性更强。