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检测蛋白敲除情况

RIPA、超声破碎仪、4℃离心机、5Xloading、4-20%预制胶、MOPS-SDS running buffer、Transferring buffer、Bio-Rad电泳仪、电泳、转膜槽、PVDF膜、甲醇、miliQ水、脱脂奶粉、TBST、ECL显色发光液。

一、蛋白样品制备：
1、胰酶消化贴壁细胞、终止消化，离心。
2、吸去培养基，用预冷的1XPBS重悬，转移至1.5mL EP管。
3、4℃离心，250g，5min。
4、吸去PBS，根据细胞计数量加入RIPA，冰上裂解30min。
5、超声10min。
6、4℃离心10min，转移上清，-80℃储存。

二、蛋白定量
1、BCA显色液定量，5mL的A液加入0.1mLB液。
2、用RIPA稀释蛋白五倍，加入配置好的BCA显色液。
3、37℃金属浴30min。
4、酶标仪检测。
5、计算实际蛋白量，根据蛋白量上样。

三、蛋白变性
用蛋白将5Xloding稀释为1X，100℃煮10min，short离心，放置于4℃准备上样。尽量保证每孔之间上样量和上样蛋白量保持一致。

四、配胶
使用4-20%梯度预制胶，搭配使用配套的MOPS-SDS running buffer，撕去胶条、拔去梳子，夹好胶板后检漏。

五、电泳
1、上样前用running buffer冲洗胶孔，冲出胶的储存液。
2、上样前用枪将蛋白混匀，混匀后更换枪头上样，尽量将枪头内的所有蛋白打出，避免气泡的产生，保持操作的一致。
3、上样完毕后，用running buffer将槽内补满（轻柔的）。
4、先100V跑25min，再上到160V跑出loading。

六、转膜
1、提前2-3h配置转膜液，放置在4℃冰箱中冷却。
2、PVDF膜甲醇活化1min，放入miliQ水中涮一下，置于转膜液中平衡。
3、胶板扣在滤纸上，缓慢剥离胶，转膜液将胶润湿，把PVDF膜缓慢贴在胶上，用滚轮将气泡滚出。
4、将三明治夹子夹紧，放入架子，在转膜槽里放两个冲洗干净的冰盒，转膜槽冰水浴，100V转膜120min。

七、封闭
用脱脂奶粉和TBST配置5%脱脂奶，充分溶化，室温封闭2h。

八、一抗孵育
1、按照条带大小切膜。
2、按照说明书用5%脱脂奶稀释抗体。
3、4℃孵育一夜。

九、二抗孵育
1、第二天早晨TBST10min/次，洗3次。
2、室温孵育1h30min。

十、显影
1、TBST10min/次，洗3次。
2、配置ECL发光液（避光），曝光。

1、加入 RIPA 时一定要快，并且在冰上，防止蛋白降解。

2、上样前蛋白样一定要混匀。

3、转膜注意不要扯到胶，不要有气泡。

4、转膜后一定要快速放入脱脂奶中，防止膜变干。

5、ECL 发光时要将发光液均匀加在膜上。

6、转膜过程保持低温。

1、条带弯曲：漏液、孔中蛋白量和上样量差别较大、胶不均一、多种条件均可导致。

2、条带不均匀：膜拱起导致显色液分布不均；转膜时三明治夹子不紧；转膜时间过短；膜上残留甲醇导致 PVDF 膜激活不均匀。

3、条带亮度不够：蛋白量过低；抗体不好用了。

4、背景黑：抗体浓度过高；TBST 洗的次数太少。