【Immortal】我的 WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

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SDS-PAGE

1、 首先将厚玻璃板和薄玻璃板用洗洁精清洗干净，在烘箱里将玻璃板烘干，或者用吹风机吹干，将玻璃板对齐后放入到架子中，注意把两侧的夹子卡紧（薄玻璃靠外，厚玻璃靠内），防止漏胶。

2、 然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。图示两块玻璃板放在一个架子上。

3、 配制分离胶（一般每块 8 ml）：根据表 1 配制分离胶，将对应组分加好后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 5 mL 枪吸取 5 mL 分离胶沿玻璃板放出，或者直接倒胶，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，加速分离胶的凝集速度。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样才不会产生气泡。加水液封时也要很慢，否则胶会被冲变型。）

4、 配制浓缩胶（2 ml）：将梳子洗干净后吹干备用，待水和胶之间有一条折线时（大约 30 min），说明分离胶已经凝固，倒去上层水并用滤纸将水充分吸干。根据表 2 配制积层胶，将对应组分加好后立即摇匀即可灌胶，灌满后小心均匀的将梳子插入即可。

5、 蛋白变性：按照样本 : 5× SDS = 4 : 1 的比例稀释样本，99℃ ，7 min 蛋白变性即可，上样时根据蛋白浓度调整上样量即可。

6、 固定玻璃板：待浓缩胶干后，将玻璃板从夹子上取下来，稍微用水冲一下， 然后用固定夹将玻璃板固定好（若跑一块胶，则槽的另一边需垫一块塑料板）。玻璃板固定好以后将固定夹夹紧并放在电泳槽内，之后往电泳槽内加入一定量的 1× 电泳液（电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板），确定没有漏液现象后用手拿住梳子的两边均匀用力，拔起梳子，准备上样。

7、 上样：在保证每孔上样量一致的前题条件下，根据蛋白浓度的测定结果计算出每孔的上样量。用微量进样器贴壁吸取样本，将样本吸出时注意不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可能会导致样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。一般最左边的泳道加入 4-5μL Marker。）

8、 凝胶电泳：上样完毕后即可开始跑电泳（跑电泳前需先确定电泳槽的正负极是否插对），电泳时间一般为 1-2h，当蛋白样本在浓缩胶中时，可适当控制电压，以便更好的浓缩蛋白样本，一般控制在 60-80V，待蛋白样本跑进分离胶后，可适当加大电压，一般控制在 100-120V，电泳至溴酚蓝跑出即可终止电泳。

(四) 转膜（湿转）

PVDF 膜：蛋白分子量＜20kDa，用0.22μm，＞20kDa，用 0.45μm 转膜时记得标记膜的正负。

1、 电泳结束后取出转移槽，并把玻璃板取下，将玻璃板撬开后即可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬时一定要小心，玻璃板很容易裂开。玻璃板撬开后将浓缩胶和分离胶上不用的部分切去。

2、 在加有转膜液的玻璃皿里放入甲醇，用于激活 PVDF 膜（1-2 min），将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回滚几遍以去除里面的气泡。在垫子上垫 1-2 层滤纸（薄滤纸两层，厚滤纸一层），一手固定滤纸，一手用玻璃棒除去其中的气泡。

3、 按照从负极（黑色）到正极（白色）的顺序依次将滤纸-胶- PVDF 膜-滤纸叠加在一起。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。转膜液中含甲醇，操作时应戴手套，并注意通风。夹子合起后可放入到转移槽中去，注意使夹子的黑色一面对操的黑面，白色的一面对槽的红面（正负极不要搞混淆）。然后往转移槽中倒入一定量的转膜液（需预冷），并在另一侧放入冰盒（用于降温）。

4、 最后把盖子合上后放入到装有冰的泡沫盒子里去，打开电源，设定恒定电流， 开始转膜（一般恒流 252mA，转膜 1-2h 即可，根据蛋白分子量确定转膜时间）。

(五) 抗体的孵育

1、 一抗的孵育：转膜结束后，即可打开盖子并取出夹子，将膜取出，将膜用 TBST 洗涤 2-3 次后，转移至含有封闭液的平皿中（5% 的脱脂牛奶（用 TBST 配）或者 5% 的BSA），室温摇床封闭 1h 后即可孵育一抗（按所需稀释浓度滴加一抗，4℃ 过夜或者 37℃ 孵育 3h）；

2、 孵育二抗：第二天取出膜，用 TBST 洗三次，每次 10min，然后加入已经配制好的二抗。室温孵育 1h，再用 TBST 洗三遍，每次 10min 即可准备显影。

(六) 显影和成像分析：一般采用化学发光法显影，并利用 BioRAD 的 ChemiDoc XRS 系统进行成像分析。
ECL 显影液 : 两个工作液=1 : 1, 10 孔一共需 200 μl。

测蛋白表达

玻璃板，电泳仪，转膜夹，转膜电极，抗体，孵育盒，电泳液，转膜液，甲醇，PVDF膜等。

SDS-PAGE

1、 首先将厚玻璃板和薄玻璃板用洗洁精清洗干净，在烘箱里将玻璃板烘干，或者用吹风机吹干，将玻璃板对齐后放入到架子中，注意把两侧的夹子卡紧（薄玻璃靠外，厚玻璃靠内），防止漏胶。

2、 然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。图示两块玻璃板放在一个架子上。

3、 配制分离胶（一般每块 8 ml）：根据表 1 配制分离胶，将对应组分加好后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 5 mL 枪吸取 5 mL 分离胶沿玻璃板放出，或者直接倒胶，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，加速分离胶的凝集速度。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样才不会产生气泡。加水液封时也要很慢，否则胶会被冲变型。）

4、 配制浓缩胶（2 ml）：将梳子洗干净后吹干备用，待水和胶之间有一条折线时（大约 30 min），说明分离胶已经凝固，倒去上层水并用滤纸将水充分吸干。根据表 2 配制积层胶，将对应组分加好后立即摇匀即可灌胶，灌满后小心均匀的将梳子插入即可。

5、 蛋白变性：按照样本 : 5× SDS = 4 : 1 的比例稀释样本，99℃ ，7 min 蛋白变性即可，上样时根据蛋白浓度调整上样量即可。

6、 固定玻璃板：待浓缩胶干后，将玻璃板从夹子上取下来，稍微用水冲一下， 然后用固定夹将玻璃板固定好（若跑一块胶，则槽的另一边需垫一块塑料板）。玻璃板固定好以后将固定夹夹紧并放在电泳槽内，之后往电泳槽内加入一定量的 1× 电泳液（电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板），确定没有漏液现象后用手拿住梳子的两边均匀用力，拔起梳子，准备上样。

7、 上样：在保证每孔上样量一致的前题条件下，根据蛋白浓度的测定结果计算出每孔的上样量。用微量进样器贴壁吸取样本，将样本吸出时注意不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可能会导致样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。一般最左边的泳道加入 4-5μL Marker。）

8、 凝胶电泳：上样完毕后即可开始跑电泳（跑电泳前需先确定电泳槽的正负极是否插对），电泳时间一般为 1-2h，当蛋白样本在浓缩胶中时，可适当控制电压，以便更好的浓缩蛋白样本，一般控制在 60-80V，待蛋白样本跑进分离胶后，可适当加大电压，一般控制在 100-120V，电泳至溴酚蓝跑出即可终止电泳。

(四) 转膜（湿转）

PVDF 膜：蛋白分子量＜20kDa，用0.22μm，＞20kDa，用 0.45μm 转膜时记得标记膜的正负。

1、 电泳结束后取出转移槽，并把玻璃板取下，将玻璃板撬开后即可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬时一定要小心，玻璃板很容易裂开。玻璃板撬开后将浓缩胶和分离胶上不用的部分切去。

2、 在加有转膜液的玻璃皿里放入甲醇，用于激活 PVDF 膜（1-2 min），将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回滚几遍以去除里面的气泡。在垫子上垫 1-2 层滤纸（薄滤纸两层，厚滤纸一层），一手固定滤纸，一手用玻璃棒除去其中的气泡。

3、 按照从负极（黑色）到正极（白色）的顺序依次将滤纸-胶- PVDF 膜-滤纸叠加在一起。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。转膜液中含甲醇，操作时应戴手套，并注意通风。夹子合起后可放入到转移槽中去，注意使夹子的黑色一面对操的黑面，白色的一面对槽的红面（正负极不要搞混淆）。然后往转移槽中倒入一定量的转膜液（需预冷），并在另一侧放入冰盒（用于降温）。

4、 最后把盖子合上后放入到装有冰的泡沫盒子里去，打开电源，设定恒定电流， 开始转膜（一般恒流 252mA，转膜 1-2h 即可，根据蛋白分子量确定转膜时间）。

(五) 抗体的孵育

1、 一抗的孵育：转膜结束后，即可打开盖子并取出夹子，将膜取出，将膜用 TBST 洗涤 2-3 次后，转移至含有封闭液的平皿中（5% 的脱脂牛奶（用 TBST 配）或者 5% 的BSA），室温摇床封闭 1h 后即可孵育一抗（按所需稀释浓度滴加一抗，4℃ 过夜或者 37℃ 孵育 3h）；

2、 孵育二抗：第二天取出膜，用 TBST 洗三次，每次 10min，然后加入已经配制好的二抗。室温孵育 1h，再用 TBST 洗三遍，每次 10min 即可准备显影。

(六) 显影和成像分析：一般采用化学发光法显影，并利用 BioRAD 的 ChemiDoc XRS 系统进行成像分析。
ECL 显影液 : 两个工作液=1 : 1, 10 孔一共需 200 μl。

上样不能太快，跑胶电压梯度设置，转膜不能有气泡，敷抗体时间合理。

同样的上样体积，跑内参，跑出来灰度值不同，显影液如何均匀滴加，转膜完成后 marker 会晕开，怎样避免转膜产热较高。