WB （western blot）-经验汇总
生物学霸
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做了很久的 WB（western blot），走了很多弯路，其实发现 WB 想要做好并不难，总结了 WB 实验中可能会遇到的问题，分析了可能的原因及对应的解决方案，希望能成为你实验成功的基石。
问题 1：转膜不充分
(1) 膜没有完全均匀湿透
使用 100% methanol 浸透膜。
(2) 靶蛋白分子量小于 10 000
选择小孔径的膜，缩短转移时间。
(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值
可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。
(4) 甲醇浓度过高
过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。
(5) 转移时间不够
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。
问题 2：背景高
(1) 膜没有完全均匀湿透
使用 100% methanol 浸透膜。
(2) 洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数。
(3) 阻断不充分
增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。
(3) 二抗浓度过高
降低二抗浓度。
(4) 检测过程中膜干燥
保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
(5) 曝光过度
缩短曝光时间。
(6) 抗体与阻断蛋白有交叉反应
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应。
问题 3：没有阳性条带
（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶失活
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
（4）试剂不匹配
一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。
（5）一抗失效
选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液。
（6）HRP 抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
问题 4：有阳性条带，但条带比较弱
（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶活性降低
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中靶蛋白含量太低
增加标本上样量。
（4）洗膜过度
缩短洗涤时间。
（5）HRP 抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
（6）抗体活性降低
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。
（7）封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。
（8）曝光时间过短
延长曝光时间。
（9）HRP 抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
问题 5：条带位置（大小）不对；或有非特异性条带
（1）二抗的非特异性结合
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。
（2）一抗的特异性不够
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。
（3）蛋白降解
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。
（4）二聚体或多聚体存在
增加蛋白质变性过程及强度。
（5）抗体浓度过高
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。
（6）蛋白上样量过大
降低上样量。
问题 6：背景有斑点
（1）封闭剂中有聚集体
使用前过滤封闭试剂。
（2）HRP 耦联二抗中有聚集体
过滤二抗试剂，去除聚集体。
问题 7：膜上出现反像（暗背景上白色带）
（1）HRP 含量过高
降低酶联二抗的浓度。
其他：
本文作者：丁香园中级站友，lrb2001
