Western-blot经验谈

哈哈,深蒙各位侠士对于兄弟的厚爱和信赖,恐怕我会令大家失望
真正做western我也做的不多,不过由于效果都不是很差,所以就对于整个过程中的某些参数对于结果的影响没有深究,正所谓真正经历实验失败的人才会对具体细节理解深刻一样,但是从关于western方面的文献和资料来看,有关各个参数对于结果的影响是有高质量的paper阐述的,所以大侠们的这些问题和想法个人认为完全是可以做出一篇小论文评述的
这两天刚好有些时间,就把曾经看的资料都大致再看了一下,自己总结了一下,可能仍然对上述大侠们的问题没有满意的解释,但可能会对大家的理解带来些许的帮助,也希望大家能提出意见和建议,在你们这些大侠面前献丑真是不好意思!

首先有必要对整个蛋白电泳的背景有些了解:
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Lammli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法,这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已,所以阐述如何操作的文字只有那么一小段(但相当经典),这是SDS-PAGE(不连续系统)的首次成功应用,现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,其实任何技术都不是平白无故的提出并实践的, Lammli提出的方法也不例外.早在1964年,Ornstein和Davis在Annals of the New York Academy of Sciences上各自发表了一篇关于圆盘电泳(Disc electrophoresis)的paper,这两篇paper首次提出了不连续的Native PAGE系统;而在1967年,Shapiro在Biochemical and biophysical research communications上的一篇paper中首次进行了连续的SDS-PAGE,以磷酸钠为缓冲体系(pH7.0),内含0.1%SDS,在样品溶解液中加入了1%SDS及!%巯基乙醇,37℃保温3h然后上样电泳.正是这两篇paper的指引下(当然还有其它的参考文献),Lammli总结了前人的智慧结晶下提出并成功运用了不连续的SDS-PAGE系统.
说了半天似乎没有回到大侠们的问题上来啊,呵呵,问题的解释已经显露出来,最初样品进行变性处理的时候Shapiro用的是37℃保温3h(之后的文献就是用这样的加热方法),而在Lammli的报道中用的是沸水浴中1.5分钟,而在另外的文献中有用60-70℃30分钟,95℃4分钟等等.我们知道蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇(二硫苏糖醇,DTT也可),SDS主要通过疏水作用与蛋白结合,一定的SDS单体浓度下,大约结合比例为1.4g SDS/1g蛋白(引自PNAS,1970,66,1002-1007,作者是Reynolds),而巯基乙醇使蛋白二硫键还原,有利于蛋白质与SDS的结合,蛋白样品被加热变性能使SDS与蛋白充分结合.其实加热不是问题的关键,比如上述的Reynolds等人制备SDS-protein样品的方法是用先用盐酸胍处理,以得到蛋白多肽的无规卷曲构象(random coil conformation)然后用含SDS与巯基乙醇的缓冲液进行透析,文中还指出,若是省去盐酸胍这一处理步骤,直接将蛋白用含SDS与巯基乙醇的缓冲液进行透析能得到一样的结合率(约1.4g/1g),同样在Reynolds的另一篇文献中(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,1970,245,5161-5165,说明一下,正是这篇研究阐述了SDS与蛋白的结合比例约为1.4g/1g)有这样的一段话:
Preparation of Protein-SDS complexes

Protein was dissolved in 6 M GuHCl and 0.1% beta-mercaptoethanol to obtain polypeptide chains in the random coil conformation . The GuHCl was
then removed by dialysis against H20 containing a reducing agent.
SDS, P-mercaptoethanol, and the appropriate buffer were dialyzed into the bag containing the protein solution. The amount of bound SDS and the concentration of protein were determined as described previously . It has been demonstrated that the same final binding ratio is reached when the complex is obtained by the above procedure as when it is formed by treating the native protein directly with SDS and beta-mercaptoethanol. Protein-
SDS complexes were formed by both procedures and compared in the experiments reported here.

所以处理的方法不管用37度保温3h,还是100度1.5min一般来说效果(形成SDS-protein复合物从而完全掩盖蛋白自身的电荷差别而使泳动率只是分子量的函数)差不多,其实可以做做这方面的实验,看哪种参数下的SDS-PAGE效果最好


我只是单单从SDS-PAGE方面给出的分析,蛋白电泳这一步做好了,western就成功一半了,至于显影方面那是涉及western具体操作上的问题,如电转移效率,显影背景如何降低等等,我能做的就到此了,至于再更加深入已经不是我能把握的了了!
用得上的顶一下！不要吝惜呀！！