【原创】Western blot 之制胶技巧，易翻车点及其解决方法汇总

说到WB制胶，相信很多同志都有说不尽的"翻车"故事。俗话说的好，工欲善其事必先利其器，SDS PAGE凝胶就是我们做WB要利的器，因为高质量的胶是跑出漂亮条带的重要前提之一。今天我们就来探讨一下制胶这个事。 一、SDS PAGE 凝胶制备 1、玻璃板梳子的清洁 先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或者吹风筒吹干，注意别用热风长时间近距离吹，厚玻璃板两侧的边条是用粘胶粘在一起的，高热会使粘胶融化，久而久之可能引起密闭性不良甚至边条脱落。 2、制胶试剂准备 超纯水，30%丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl，pH6.8Tris-HCl，10%SDS，10%过硫酸铵（APS），TEMED，还有95%酒精（压胶用）。注意试剂的有效期，是否澄清透明，若有沉淀或晶体析出，请更换。30%丙烯酰胺注意避光4度保存。pH8.8Tris-HCl和pH6.8Tris-HCl容易出现沉淀，另外注意这两个试剂有两个浓度的，分别是1.0M和1.5M，根据你的配方表来买。10%SDS低温（4度以下）时容易结晶析出。APS化学性质活泼，常温下暴露于空气下容易变质失效，一般建议配好后分装冻于-20度冰箱。TEMED气味恶臭，挥发性强，具有神经毒性，使用时屏住呼吸，在通风的环境下使用，注意密闭避光保存于4度。 3、制备分离胶 按照配方表依次加入相应体积的试剂（1.0mm玻璃板一块胶总体积5.0ml，1.5mm玻璃板一块胶总体积7.5ml足矣），加完SDS后加APS前可以先混匀，然后迅速加入APS和TEMED,马上混匀（手摇或者振荡器摇匀），灌胶，注意胶的高度，要留有足够的空间给压缩胶，一般压缩胶的深度要求是梳子下缘再往下1厘米左右。然后用95%酒精压胶，注意加酒精时要缓缓注入，并且要边加边移动枪嘴，以免酒精在同一位置冲出一个凹陷。室温静置25分钟。 4、制备压缩胶及插梳子 先判断下层胶是否已经凝固，然后倒掉酒精，再用吸水纸吸干残余酒精，注意纸不能戳到胶面。然后按步骤3操作，混匀上层胶试剂后迅速灌胶，可以直接倒，但要注意别倒多了导致其他玻璃板不够，然后迅速插梳子，一次性操作，不可拔出再插。室温静置20分钟。 5、凝胶的暂存 根据剩余在离心管中的上层胶是否已经凝固来判断玻璃板中的