【原创】Western blot使用体会
丁香园论坛
2060
读硕士时曾经想发表的关于蛋白印迹法（Western blot）的使用体会，但因为缺少较多样本对比分析，所以没有投得出。但我觉得实验中经过一些挫折后得到些体会，应该与大家分享一下。否则有点可惜了。也希望由此获得加分机会。
蛋白印迹法的使用体会
蛋白印迹法（Western blot）是分子生物学实验中研究蛋白质的一种重要方法。可用来半定量测定标本中的目的蛋白。由于标本中目的蛋白含量有限，为提高检出率，最后一步可以用化学发光法替代显色法，从而使检测水平由微克级（ug）提高到纳克级（ng）。然而，很多情况下，仍然因蛋白含量低而不能得出满意的结果。我实验中采用的标本是恶性血液病病人的骨髓细胞，由于骨髓采集量有限，同时所需测定的目标蛋白含量较低，实验中挫折不少，经过不断摸索，终于得到较为满意的结果。现将我在实验中的体会简述一二，以供大家参考。
常规蛋白印迹法基本步骤为：提取蛋白质---蛋白质电泳---转移电泳---抗体孵育---酶底物反应显色，为提高检测效率，可以在每个环节都作一些改进。
1.以化学发光法替代显色法
当目的蛋白含量非常低时，首先应当选用最好的检测手段。化学发光法具有灵敏度高，又没有同位素污染的威胁，因此是优选方法。常规酶反应显色法是通过抗体上标记的酶---常为辣根过氧化物酶，与新鲜配制的底物液---相应的联苯胺（DAB）发生显色反应，呈现棕色条带，优点是简便，价廉，缺点是只能测到微克级蛋白量，而且需立即照相、扫描，否则，时间一久，会褪色。化学发光法则是通过抗体上标记的酶---常为辣根过氧化物酶，与新鲜配制的底物发光液---相应的鲁米诺发生发光反应，在暗室中使X光胶片感光，经显影、定影之后，X光胶片上呈现黑色条带，优点是检测水平达纳克级，结果可长期保存。缺点是价格略高，还需暗室等相应实验室条件。
2.蛋白质提取方法改进
由细胞提取蛋白质常规是用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液直接裂解细胞，在收集的细胞中加入裂解液（0.5ml/107）4℃振荡60分钟，17000g，4℃离心后取上清，（裂解液配方[1]：50mM Tris-HCl，PH7.5；0.3M NaCl；1%Nonidet P40；0.1%去氧胆酸钠；0.1%SDS；1mM EDTA；10mM 焦磷酸钠；50mM 氟化钠；1mM 偏钒酸钠。临用时新鲜加入20ug/ml抑肽酶；20ug/ml亮肽酶；10ul/ml 100mM PMSF。）
我也曾用Tripure TM分离试剂（Roche公司）用分步提取法在提取DNA，RNA的同时提取蛋白质。（每5-10×106个白细胞加1ml TripureTM分离试剂；反复吹打细胞，在室温下孵育5分钟；每个样本中加氯仿0.2ml；盖好试管盖，强烈摇晃15秒；室温孵育5分钟；4℃ 12000g离心15分钟，分离成三层；仔细分离所有上层水相，在中层和下层中加100%乙醇0.3ml，盖上盖，颠倒数次以混匀；室温下孵育2-3分钟，4℃，2000g，离心5分钟；吸取上清，在上清中加异丙醇1.5ml，盖上盖，颠倒数次以混匀；室温下孵育至少10分钟，4℃，12000g离心10分钟；弃上清，洗涤沉淀的蛋白质3次[每次用0.3M胍盐酸盐（95%乙醇溶解）2ml重悬蛋白质；室温下孵育20分钟；样本离心，4℃，7500g，5分钟；弃上清]；加2ml 100%乙醇，洗蛋白小粒，室温孵育20分钟后4℃，7500g离心5分钟；弃上清；风干或真空抽干5-10分钟；用1%SDS（用量根据蛋白小粒大小决定）溶解蛋白小粒，用吸管反复吸打溶液，50℃孵育以完全溶解蛋白质；10000g 4℃离心 10分钟。将含蛋白质的上清移至新的试管中。）
我比较了6例标本分别用Tripure TM法、常规裂解法提取蛋白后所得actin含量，提取效率无明显差异。但前者在提取的最后一步，SDS用量可根据需要，可能进一步提高蛋白质溶液的浓度。而常规裂解法裂解液量过少将不能充分裂解细胞。
而且，用Tripure TM法提取蛋白质的同时，可进一步分离到DNA、RNA，有利于进一步研究，节约标本。而常规提取法操作简便，快捷，如果标本来源充足，细胞数多，也不失为一种好方法。
3.蛋白质电泳的改进
3.1 配制高浓度的载样缓冲液
SDS-PAGE蛋白电泳[2]使用的载样缓冲液由1×到6×不等，我开始实验中采用的是3×缓冲液，结果不理想，经过重新配制6×缓冲液，使加样蛋白含量增加，从而提高了检测率。
3.2 选择加样口窄而厚的电泳槽
一般蛋白电泳选用薄的电泳槽，目的是提高分辨率，使分子量接近的不同蛋白条带分隔清晰。但这样一来，蛋白转移电泳时，转移到单位面积膜上的蛋白量较少。如采用厚的电泳槽，凝胶单位截面上的蛋白量较多，转移到单位面积膜上的蛋白量也较多，从而提高灵敏度。选用窄的槽是为了节约样品加样量，因为厚的电泳槽如宽度不缩短，相应的样品加样量就增加了，对于样品量少的标本就不能使用。因此，选用窄而厚的电泳槽，即增加检测的灵敏度又一定程度上节约了标本。
4.转移电泳条件
我实验检测的蛋白分子量为27KD及43KD，选用了80V恒压转移1.5小时至PVDF膜，转移中产热较多，故降温尤为重要。曾使用恒流30mA转移过夜，效果不佳，转移效率低。
至于转移膜，PVDF膜优于硝酸纤维膜，后者结合蛋白量少，而且背景高，柔韧性差，易损坏。但前者价格较高。
5.抗体孵育
选用多克隆抗体灵敏度高，单克隆抗体特异性高。实验时从高浓度起试用，逐渐降低浓度至最适浓度。
6.化学发光条件
6.1化学发光液新鲜配制，理论上可以用一周，但实际最多保存三天。因为前面大量工作与精力已投入，如因最后发光失误，实在可惜。
6.2膜与化学发光液作用完毕后立即在暗室用暗盒使X光胶片感光，如时间过久，发出的荧光会衰减，因此，化学发光时最好就在暗室中进行。感光时间由60秒开始，根据感光效果，调节暴光时间，短期内可以多次暴光，获得多张X光片。X光片可长期保存。
总之，我在实验中感到，TripureTM法与常规裂解法提取蛋白相比，提取效率无明显差异，采用TripureTM法提蛋白，可有效利用标本，在提高检测率方面，用6×载样缓冲液，窄而厚的电泳槽，80V恒压转移1.5小时，采用PVDF膜，发光后及时使X胶片暴光是较为关键的。
参考文献
1. Yokozawa T, Towatari M, Iida H, et al. Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27Kip1 in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia 2000;14(1):28-33
2. [美]J ·萨姆布鲁克等《分子克隆学实验指南》（第二版）北京：科学出版社1993；880-892
蛋白印迹法的使用体会
蛋白印迹法（Western blot）是分子生物学实验中研究蛋白质的一种重要方法。可用来半定量测定标本中的目的蛋白。由于标本中目的蛋白含量有限，为提高检出率，最后一步可以用化学发光法替代显色法，从而使检测水平由微克级（ug）提高到纳克级（ng）。然而，很多情况下，仍然因蛋白含量低而不能得出满意的结果。我实验中采用的标本是恶性血液病病人的骨髓细胞，由于骨髓采集量有限，同时所需测定的目标蛋白含量较低，实验中挫折不少，经过不断摸索，终于得到较为满意的结果。现将我在实验中的体会简述一二，以供大家参考。
常规蛋白印迹法基本步骤为：提取蛋白质---蛋白质电泳---转移电泳---抗体孵育---酶底物反应显色，为提高检测效率，可以在每个环节都作一些改进。
1.以化学发光法替代显色法
当目的蛋白含量非常低时，首先应当选用最好的检测手段。化学发光法具有灵敏度高，又没有同位素污染的威胁，因此是优选方法。常规酶反应显色法是通过抗体上标记的酶---常为辣根过氧化物酶，与新鲜配制的底物液---相应的联苯胺（DAB）发生显色反应，呈现棕色条带，优点是简便，价廉，缺点是只能测到微克级蛋白量，而且需立即照相、扫描，否则，时间一久，会褪色。化学发光法则是通过抗体上标记的酶---常为辣根过氧化物酶，与新鲜配制的底物发光液---相应的鲁米诺发生发光反应，在暗室中使X光胶片感光，经显影、定影之后，X光胶片上呈现黑色条带，优点是检测水平达纳克级，结果可长期保存。缺点是价格略高，还需暗室等相应实验室条件。
2.蛋白质提取方法改进
由细胞提取蛋白质常规是用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液直接裂解细胞，在收集的细胞中加入裂解液（0.5ml/107）4℃振荡60分钟，17000g，4℃离心后取上清，（裂解液配方[1]：50mM Tris-HCl，PH7.5；0.3M NaCl；1%Nonidet P40；0.1%去氧胆酸钠；0.1%SDS；1mM EDTA；10mM 焦磷酸钠；50mM 氟化钠；1mM 偏钒酸钠。临用时新鲜加入20ug/ml抑肽酶；20ug/ml亮肽酶；10ul/ml 100mM PMSF。）
我也曾用Tripure TM分离试剂（Roche公司）用分步提取法在提取DNA，RNA的同时提取蛋白质。（每5-10×106个白细胞加1ml TripureTM分离试剂；反复吹打细胞，在室温下孵育5分钟；每个样本中加氯仿0.2ml；盖好试管盖，强烈摇晃15秒；室温孵育5分钟；4℃ 12000g离心15分钟，分离成三层；仔细分离所有上层水相，在中层和下层中加100%乙醇0.3ml，盖上盖，颠倒数次以混匀；室温下孵育2-3分钟，4℃，2000g，离心5分钟；吸取上清，在上清中加异丙醇1.5ml，盖上盖，颠倒数次以混匀；室温下孵育至少10分钟，4℃，12000g离心10分钟；弃上清，洗涤沉淀的蛋白质3次[每次用0.3M胍盐酸盐（95%乙醇溶解）2ml重悬蛋白质；室温下孵育20分钟；样本离心，4℃，7500g，5分钟；弃上清]；加2ml 100%乙醇，洗蛋白小粒，室温孵育20分钟后4℃，7500g离心5分钟；弃上清；风干或真空抽干5-10分钟；用1%SDS（用量根据蛋白小粒大小决定）溶解蛋白小粒，用吸管反复吸打溶液，50℃孵育以完全溶解蛋白质；10000g 4℃离心 10分钟。将含蛋白质的上清移至新的试管中。）
我比较了6例标本分别用Tripure TM法、常规裂解法提取蛋白后所得actin含量，提取效率无明显差异。但前者在提取的最后一步，SDS用量可根据需要，可能进一步提高蛋白质溶液的浓度。而常规裂解法裂解液量过少将不能充分裂解细胞。
而且，用Tripure TM法提取蛋白质的同时，可进一步分离到DNA、RNA，有利于进一步研究，节约标本。而常规提取法操作简便，快捷，如果标本来源充足，细胞数多，也不失为一种好方法。
3.蛋白质电泳的改进
3.1 配制高浓度的载样缓冲液
SDS-PAGE蛋白电泳[2]使用的载样缓冲液由1×到6×不等，我开始实验中采用的是3×缓冲液，结果不理想，经过重新配制6×缓冲液，使加样蛋白含量增加，从而提高了检测率。
3.2 选择加样口窄而厚的电泳槽
一般蛋白电泳选用薄的电泳槽，目的是提高分辨率，使分子量接近的不同蛋白条带分隔清晰。但这样一来，蛋白转移电泳时，转移到单位面积膜上的蛋白量较少。如采用厚的电泳槽，凝胶单位截面上的蛋白量较多，转移到单位面积膜上的蛋白量也较多，从而提高灵敏度。选用窄的槽是为了节约样品加样量，因为厚的电泳槽如宽度不缩短，相应的样品加样量就增加了，对于样品量少的标本就不能使用。因此，选用窄而厚的电泳槽，即增加检测的灵敏度又一定程度上节约了标本。
4.转移电泳条件
我实验检测的蛋白分子量为27KD及43KD，选用了80V恒压转移1.5小时至PVDF膜，转移中产热较多，故降温尤为重要。曾使用恒流30mA转移过夜，效果不佳，转移效率低。
至于转移膜，PVDF膜优于硝酸纤维膜，后者结合蛋白量少，而且背景高，柔韧性差，易损坏。但前者价格较高。
5.抗体孵育
选用多克隆抗体灵敏度高，单克隆抗体特异性高。实验时从高浓度起试用，逐渐降低浓度至最适浓度。
6.化学发光条件
6.1化学发光液新鲜配制，理论上可以用一周，但实际最多保存三天。因为前面大量工作与精力已投入，如因最后发光失误，实在可惜。
6.2膜与化学发光液作用完毕后立即在暗室用暗盒使X光胶片感光，如时间过久，发出的荧光会衰减，因此，化学发光时最好就在暗室中进行。感光时间由60秒开始，根据感光效果，调节暴光时间，短期内可以多次暴光，获得多张X光片。X光片可长期保存。
总之，我在实验中感到，TripureTM法与常规裂解法提取蛋白相比，提取效率无明显差异，采用TripureTM法提蛋白，可有效利用标本，在提高检测率方面，用6×载样缓冲液，窄而厚的电泳槽，80V恒压转移1.5小时，采用PVDF膜，发光后及时使X胶片暴光是较为关键的。
参考文献
1. Yokozawa T, Towatari M, Iida H, et al. Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27Kip1 in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia 2000;14(1):28-33
2. [美]J ·萨姆布鲁克等《分子克隆学实验指南》（第二版）北京：科学出版社1993；880-892
