穷人的劳斯莱斯-我的五年western blot体会

1.抗体的选择

对于国内的大多数实验室来讲，做 western blot 实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot 实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。

进口抗体一般不会出现闪失：abcam 品种全，质量过硬，但价高（3400 元/100 微升），而且说是 100 微升，但至多能吸出来 90 微升；Sigma 的价最贵；比较有性价比的是 CST 的抗体，现在好像是2200 元/100 微升，我前后用过二十几种， 1:1000 的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和 western blot 实验，还有一个优点是通常量比 100 微升多出来 10 微升，唯一的不足是 CST的品种实在不多。Santa 的多克隆抗体质量可以，但是选用 Santa 的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。

进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420 元/ 100微升），大概好抗体的比例约为 50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。

具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。

国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。

我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候 1：10000 都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。

2.Western Blot设备

目前最好的垂直槽和转移槽还是 Biorad（伯乐），尤其是 MINI3 好用,MINI4 可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且 MINI4 用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了 MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。

Biorad 的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的 MINI3 几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是 5 千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。

不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。

3. Western Blot实验条件

Western Blot 实验条件我基本是按 ABCAM 公司经典教材做的，具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国 biomol 原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价格比 sigma 的便宜许多，1 公斤好像是 480 多人民币，够实验室用好长时间，现在我们实验室做双向电泳都用 biomol 的胶，很好用。Marker 我现在用 fermantas 的 SM1811,2 微升就很清晰了，兰州的代理是上海生工。

要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE 的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。

转膜我通常是快转两百 200 毫安/ 2 小时，慢转 80 毫安/ 12 小时。快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。封闭我通常用 BD 的脱脂奶粉，不归，260 元 500 克，也是从北京华美买的。ECL 我用 pierce 的，500 毫升 1650 元，比国产的还便宜好用。胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶。

4. Western Blot实验关键

Western Blot 操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。

Actin，Tubulin，GAPDH 我都用过，Actin，Tubulin 的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是 GAPDH。如果用心看看 cell，nature， science 上的文章，大多用 GAPDH 做内参。进口的，国内分装的，国产的，我都用过。

进口的最强的 1:10000 都能做出条带（Upstate，现在被 Minipore 招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。我要特别强调的是，实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体，因为只要 Western Blot 开工，每次都得用内参抗体，而一般目的蛋白的抗体也就用几次，重复三次就了事。

但内参抗体是不折不扣的耗材，严格意义上将，每跑一次胶，就得杂一次内参，使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体，但好像因为种属同源性太高，背景总是不干净。进口的好，太贵；国产的只能使用一次，年终算账，不比进口的便宜。

我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事，为什么国内企业高的早不了，低的造不好呢？现在我用的是杭州贤至的 GAPDH 兔多抗，200 微升 420 元钱，我在蛋白上样量 12 微升/孔的情况下，按 1:2000 稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:4000 照样能做出来，因为按按 1:2000 稀释做，在暗室里点上 ECL 后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交，可回收重复使用 5 到 6 次。

最早我是 2008 年在丁香通上看到了杭州贤至（当时名叫杭州松华）发布的广告，我就怂恿实验室主管买了2支，很好用，现在实验室都没有用完 ；2009年我的一个朋友做western，我推荐他又买了1支，做出来的效果确实好，2009 年底我到了新的实验室，western 的全套我在新实验室重新建立，啥都采购齐了，可就是买不到杭州松华的内参抗体，我上网再也找不到这个公司的网页了，没办法，只好一直噌朋友的内参抗体用。

我有个陋习，就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好，今年 7 月份我终于找到了当年的通讯记录，一联系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技有限公司了，呵呵，改了个名，害我找了大半年。第三次买到的 GAPDH 内参抗体，还是好用，1:2000，条带清晰，回收重复用，照样 work，截止目前，我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的，嘿嘿！草根出生，我也照样有我穷人的劳斯莱斯。