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蛋白质表达检测

SDS-PAGE 配胶、电泳设备、转膜设备、摇床、离心机、超声仪、酶标仪、EP管、离心管、枪头。

一、细胞样品总蛋白提取：RIPA 裂解法
1、取适量的 RIPA 裂解液, 在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂。

2、RIPA 裂解液加入至 6 孔板，冰上裂解 10 min，使用细胞刮刀收集蛋白，放于 EP 管中。

3、收集好的细胞进行超声处理，4℃，12000rm，离心 15 min，去除核酸沉淀。

4、使用 BCA 法测定蛋白后，加入 5xSDS 蛋白上样缓冲液后，95℃ 变性 10 min后，可用于 WB 实验检测。

二、BCA 蛋白定量：BCA 蛋白定量试剂盒
1、使用时将 Solution A 摇晃混匀, 根据样品数量, 按 Solution A ：Solution B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。

2、完全溶解蛋白标准品（5mg/ml BSA），取 10μl 稀释至 100μl，使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中, 蛋白标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀释蛋白标准品。

3、将稀释后标准品（0.5mg/mlBSA）按 0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到 96 孔板中, 加标准品稀释液补足到 20μl。

4、加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中, 加标准品稀释液补足到 20μl。

5、各孔加入 200μl BCA 工作液，注意不要弄出气泡，否则影响读数，37℃ 放置 30-60分钟。

6、冷却到室温后, 用酶标仪或者分光光度计测定 A562 波长的吸光度。

7、建立标准曲线，计算出检测样品中的蛋白浓度。

8、蛋白质变性：蛋白提取液与蛋白上样 Buffer 按比例进行混匀，水浴锅/金属浴 95℃ 以上处理 10 分钟，中间涡旋 1 次。

三、SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳
注意：

1、10% AP 要现用现配

2、TEMED配置时要最后加入溶液中。混合均匀后，应立即灌胶防止凝固。

1、玻璃板检漏：
（1）将玻璃制胶器组装好，检查是否漏水，配制浓度12%的分离胶（两块胶15ml），将分离胶加入玻璃板中间，每块1.5 mm的玻璃板加7 ml，最后缓慢加酒精液封。
（2）待出现明显固液界面（约20-30min）后将酒精倒掉，胶面平直，配置5%的浓缩胶，加入并插入梳子，插入过程中要防止胶内带入气泡。待胶彻底凝固后把胶放置在PE手套中，并加少量的水，室温保存。
注意：凝胶时间与温度相关，夏天温度高，一般30min，即可，冬天凝胶时间延长至40min-60min左右。每周配置多块胶，室温备用（配置好的凝胶室温可放置一周左右）。

2、上样：凝胶与电泳槽组装好，取下梳子，用针将孔道拨正，加入undefinedSDS电泳缓冲液。加好电泳液后开始准备上样。通过BCA试剂盒定量后确定每孔的上样量，用微量移液枪吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将枪头伸入加样孔中缓慢加入样品。

3、电泳：先稳压 80V电泳 20min 左右，等蛋白进入分离胶，Marker 开始分开后，将电压调至 100 V，等 loading buffer 或溴酚兰距离胶底 1-2 cm，即结束电泳。电泳总时间控制 1-1.5 小时左右。

4、考马斯亮蓝 R250（容易洗脱）染色及脱色：
（1） 凝胶置约 100 mL 染色液中染色。室温下，在摇床上染色2h。
（2） 弃去染色液，将凝胶浸没在大约 100 mL 蒸馏水中，放入微波炉中，中火煮沸。至凝胶脱去背景色，条带清晰为止。大约煮沸20 min左右，换水后室温摇床继续进行脱色，隔天后背景基本干净。

5、转膜：（湿转）
（1）切胶。从胶板底部轻轻撬起玻璃，用转膜液润湿胶面，根据 Marker 的位置以及所需蛋白分子量切胶。
（2）准备滤纸以及 PVDF 膜。根据胶的大小，剪两张和胶大小一样的厚滤纸，浸入转膜液，再剪一张和胶一样大小的 PVDF 膜，将此膜浸泡在甲醇溶液中活化 5min ，取出浸入转膜液中平衡 5min 左右。
（3）三明治模型。从转印液中取出1层滤纸，整齐的平铺于电转槽的夹子黑色面正中间，将胶平移至滤纸上，将浸泡于转印液中 PVDF 膜放置在胶上，再倒一些转膜液到膜上，保持膜的湿润；再在 PVDF 膜上放置1层厚滤纸。
（4）赶气泡。一手压住滤纸一端，一手用离心管在滤纸上轻轻滚动以赶走膜、胶以及滤纸之间的空气。三明治夹板制作好后，盖上电转槽盖，200 mA 转印 60 min。转膜过程中，转膜槽放置在冰上。
注意：在三明治模型中，胶靠近黑色面（负极），膜靠近透明面（正极）；转膜缓冲液回收，使用 3 次后，配置新的转膜液。

6、丽春红染色：转膜结束，打开夹子，用镊子夹出 PVDF 膜，放到 undefinedTBST 里漂洗 5 min，有蛋白的一面朝上，为正面。用圆珠笔在膜的正面（转膜时靠近胶的一面）做好标记，将膜用 1×丽春红染液染10min（于摇床上摇），然后用水漂洗掉多余的染液就可看到膜上的蛋白条带，根据实验的需要，以及目的蛋白分子量大小，可以把一张膜分为几张，分别孵育不同抗体，检测不同蛋白；将膜分开放入抗体孵育盒小格子中，加封闭液（5％ 溶于 TBST 的脱脂奶粉，）。

7、封闭：在封闭液（5％ 脱脂奶粉，溶于 TBST）中室温缓慢摇荡1h。封闭结束，TBST 洗膜 1 次，5min。
注意：5％ 脱脂奶粉提前配置，使充分溶解，每次实验都配置新的。

8、一抗、二抗的孵育：（摇床辅助完成）

（1）用一抗稀释液按比例稀释，用移液枪加入抗体孵育盒中，一抗用量必须彻底没过膜，室温1h。并且在抗体孵育盒标清楚抗体的种类，来源。（β-actin：1：5000 稀释使用）
（2） 1×TBST 洗 5 次，每次 5min。根据一抗来源选择合适二抗，用二抗稀释液稀释，加入抗体孵育盒中，室温孵育 1 小时；(1：5000稀释使用)
（3）孵育结束后，TBST 洗 5 次，每次 5 min。
注意：一抗、二抗稀释液为 5% 的脱脂奶粉，使用时提前一小时配置使奶粉充分溶解；同时操作过程中，防止膜干燥。

9、显色：将 ECL 发光液和稳定液等体积混合，一张膜配置 0.5mL 即可。将膜背面贴在一次性手套，吸水纸吸除多余 TBST；将混匀的 ECL 滴加到膜上。在凝胶成像系统进行曝光拍照。

（1）配胶时注意洗干净玻璃板、凝胶液涡旋混匀、AP 现用现配，凝胶时间不易过长。
（2）脱脂奶粉在电泳前进行准备配置，使其溶解充分
（3）转膜时注意赶气泡、降温，使用冰盒。
（4）提取蛋白时尽可能保持低温、裂解液在使用前加入蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂。
（5）室温温度比较低的时候 SDS 容易结晶，放进温箱待彻底溶解后再进行使用。
（6）AP 试剂受潮后失效，建议进行小份分装。
（7）电泳转膜时一定注意正负极不要弄反，单块胶进行电泳时使用配套的塑料板组合成闭合的电路，防止短路。
（8）抗体的选择，选择大品牌、特异性高的抗体。进行预实验，摸索抗体稀释比例。注意二抗的选择与一抗的来源相关。
（9）转膜后的膜后续保持湿润状态。
（10）ECL 选择： ECL 试剂目前有普通的、高敏的、超敏的。三类之分。根据蛋白表达水平选择合适的ECL 发光液。
（11）曝光仪器：曝光时选择高分辨率进行曝光

1、配置凝胶发现产时间胶没有凝
2、转膜后丽春红染色发现有白色的圆圈-气泡
3、曝光后发现没有条带
4、曝光后发现杂带多
5、曝光后发现膜上有小黑点。
6、曝光后发现条带弯曲、笑脸状。
7、曝光后发现某一个样品的条带出现中间淡，两头粗。
8、曝光后发现条带颜色淡、或者出来不全？
9、曝光后发现条带奇怪，呈“竖直”状？