【番茄】我的 WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

应用 western blot 技术对蛋白进行定性和半定量分析

洗洁精，无水乙醇，蒸馏水，DDW，30% Acr-Bis（29：1），分离胶缓冲液，浓缩胶缓冲液，10% APS，TEMED，冰，电泳液，电转液，TBS液，TBST液，5% 脱脂牛奶，一抗溶液，二抗溶液，镊子，计时器，制胶架，玻璃板，EP管，震荡仪，移液枪（1000μl，500 μl，100 μl，10 μl）及相应匹配的枪头，胶头滴管，加样梳，电泳槽，水盆，滤纸，PVDF膜，剪刀，海绵，电转槽，玻璃皿，摇床，抗体孵育袋，暗盒，奥德赛红外扫膜仪等。

（一） 配胶
1. 洗玻璃板：用洗洁精洗净，再用蒸馏水冲洗后，使用无水乙醇进行润洗，放置，自动晾干（或使用吹风机吹干）；
2. 配置分离胶：制备 5 ml/gel的分离胶，用合适规格的移液枪吸取 1.9 ml/gel DDW、1.7 ml/gel 30% Acr-Bis（29：1）、1.3 ml/gel 分离胶缓冲液、0.05 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED 于 EP 管，使用震动仪混匀后放置通风橱；
3. 安装制胶架：将玻璃短板和长板置于制胶架，注意将两块板下层对齐，卡紧，移至通风橱用以注胶；
4. 注入分离胶：用胶头滴管吸取分离胶，小心注入，直至分离胶上缘至长板上缘2 cm左右处，顶层注入无水乙醇，等待30 min后凝胶，倒出无水乙醇；
5. 配置浓缩胶：制备 2 ml/gel的分离胶，用合适规格移液枪吸取 1.15 ml/gel DDW、0.33 ml/gel 30% Acr-Bis（29：1）、0.5 ml/gel 浓缩胶缓冲液、0.02 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED于EP管，使用震动仪混匀后放置通风橱；
6. 注入浓缩胶：用胶头滴管将浓缩胶注入预留好的 2 cm空隙，小心插入加样梳，注意不要残留气泡，等待 30 min凝胶；

（二） 上样与电泳
1. 将玻璃板从制胶架拿出，放入提前洗净的电泳槽内固定，垂直拔出梳子，在内槽加入足够电泳液，冲出加样孔内的气泡，根据所需上样量，使用相应的移液枪在上样孔加入样品及 marker；
2. 上样完毕后，在外侧电泳槽加入电泳液至相应刻度处（ 2板 or 4 板），盖上电泳槽的盖子（注意正负极）；
3. 打开电源，于 80 V电压下电泳，等待样品下缘齐平后调至 120 V，等待大约 90 min 溴酚蓝跑至即将出胶的位置。

（三） 转膜
1. 准备相应大小的一张 0.45 μm 或 0.22 μm PVDF膜（孔径根据目的蛋白分子量确定，低于 20 kDa 小分子可选择孔径小的膜）和四张滤纸，置于电转液中浸泡，PVDF膜先于甲醇中活化；
2. 翘开玻璃板剥胶于电转液中，洗去残留的电泳液，后小心置于电转夹上，不能有气泡，电转夹板黑色板（负极）置于下部，按照“海绵-滤纸-胶-PVDF 膜-滤纸-海绵”的顺序安装好，每一步都要避免气泡；
3. 夹紧后放入电转槽中（电转槽预先放入加冰的塑料盆内），电转液加满并加冰块，295 mA 下转膜 1.5 h或2 h（转膜时间依据目的蛋白分子量大小决定，大于 200 kDa 的蛋白可适当延长转膜时间）。

（四） 洗膜
电转完成后，将 PVDF 膜放进玻璃皿，用 TBS 溶液浸泡，放于摇床上 90 r/miundefined5 min，重复三次,洗去残留的电转液。

（五） 封闭
弃去 TBS 液，5% 脱脂牛奶浸泡 1 h，60 r/min。

（六） 抗体孵育
1. 加一抗：将 PVDF 膜用 TBS 液浸洗三次，90 r/miundefined 5 min，根据目的蛋白及内参蛋白的分子量确定裁膜位置，装入抗体孵育袋，并加入适宜量的一抗溶液（2-3 ml为宜），小心封好，不要挤压PVDF膜，放入冰箱，4°C 过夜；
2. 加二抗：
（1） 过夜后取出，将抗体孵育袋放到摇床上恢复室温30 min，60 r/min，回收一抗；
（2） 将PVDF膜取出（注意镊子夹在膜的边缘位置），用TBST液浸洗三次，每次5-10 min，90 r/min；
（3） 将PVDF膜放入暗盒，加入带有荧光的二抗溶液，放置于摇床孵育90 min，60r/min；
（4） 结束后用TBST液浸洗三次，每次5-10 min，90 r/min；
（5） TBS液浸洗一次，5-10 min，90 r/min；

（七）奥德赛红外扫膜仪显影
注意避光以及膜的整洁。

1. 移液枪的枪头需要一用一换（DW 可不需要），且小枪头需要伸入液面以下，确保枪头无残留；

2. 放置制胶架时，玻璃长板和短板需要下缘完全对齐，防止胶从下缘渗出导致配胶失败；

3. 无水乙醇封住分离胶时需彻底，不可留气泡，防止分离胶挥发使配胶失败；

4. 浓缩胶注入完毕，插梳时，注意梳子每格空隙间不能预留气泡，防止凝胶后，胶的上缘凹凸不平影响后续蛋白样品电泳；

5. 加样时，内侧电泳槽需填满电泳液，防止胶和样品变干影响电泳；

6. 转膜时夹板需夹紧且避免气泡，防止转膜时膜上印迹不清或因为气泡而影响显影；

7. 5% 脱脂牛奶封闭时，注意牛奶尽量纯净完全混匀，且时间适宜，过长过短都会影响结果；

8. 二抗孵育时应注意使用暗盒并避光，防止荧光失效，导致显影结果不明显；

1. 分离凝胶较窄：可能由于玻璃长、短板下缘未对齐，分离胶从下缘漏出；

2. 显影结果有不均匀白色斑点：转膜过程中未清除气泡；

3. 显影条带不清晰、信号弱：转膜时不充分或者封闭时间过长；

4. 显影结果杂带较多：一抗或二抗不纯，不能够特异性结合或者封闭时间过短；

5. 显影条带呈笑脸状：配胶不均匀冷切，中间冷却不充分，电转系统温度较高；

6. 显影条带呈皱眉状：凝胶和玻璃板贴合不紧密，中间有气泡；

7. 显影条带拖尾：样品不纯导致电泳时样品蛋白分离到胶的不同位置；

8. 无蛋白条带：试剂（如一抗和二抗）不匹配或者试剂失效。