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蛋白质表达检测

SDS-PAGE 配胶、电泳仪、转膜仪、摇床、离心机、酶标仪、EP 管、移液枪及枪头。

蛋白样本制备：

一、组织全蛋白样本制备：
（1)）称量组织，20 mg组织加入1 ml 裂解液（1xRIPA:蛋白酶抑制剂：磷酸化抑制剂=100:1:1）；
（2）研磨组织，将组织放置在 2 ml EP 管中，置于冰上研磨至肉眼看不见组织即可；
（3）离心机 4℃ 12000 rpm离心 20 分钟；
（4）分装上清，弃沉淀；
（5）变性蛋白，上清中加入 5xSDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，用干式恒温器100℃ 变性 5 分钟，置于冰上冷却后放在 -20℃ 冰箱保存。

二、细胞全蛋白样本制备：
（1）配制细胞裂解液：取适量 Lysis Buffer 在使用前加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1 mM，充分振荡混匀，冰上预冷备用；
（2）取聚合度为 70% ~ 80% 且无污染的细胞，PBS 洗涤三次，弃废液。加入适量配制好的细胞裂解液（10 cm培养皿加入 200 ~ 250 μL，6 cm培养皿加入100~150 μL）均匀分布培养皿皿底充分接触细胞。用细胞刮刀刮取细胞及细胞裂解液，移至 1.5 mL EP 管中，剧烈振荡 15 秒，冰上静置 30 分钟，每 10 分钟振荡一次；
（3）置入预冷至 4 ℃的高速离心机中，12000 rpm 离心 20 分钟，取上清至新的EP 管中，标记好细胞名称；
（4）根据蛋白质溶液体积加入相应体积 5×SDS 上样缓冲液，使其终浓度为 1×，用干式恒温器 100℃ 变性 5 分钟，置于冰上冷却后放在 -20℃ 冰箱保存。

BCA蛋白定量：
（1）标准曲线孔：96 孔板中取 6 个孔，分别加入 0 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL 、20 μL 浓度为 0.5 μg/mL 的标准蛋白，PBS缓冲液补充每孔体积至20 μL;
（2）蛋白样品孔:每个蛋白样品设置三个复孔，每孔加入 18 μL PBS 缓冲液和 2 μL样品蛋白；
（3）配制 BCA 反应液：试剂A :试剂 B = 50 : 1，用涡旋振荡器充分混匀后，每孔加入 200 μL反应液，37 ℃ 恒温箱中避光反应 30 min；
（4）酶标仪 A562 nm 检测吸光度；
（5）根据标准蛋白浓度与测得吸光度计算得出标准蛋白的标准曲线和线性回归方程（R²≥0.99），根据此方程及蛋白质样品吸光度值计算各蛋白质样品浓度。

配胶、电泳、转膜、封闭、敷抗体、显影：
（1）用洗洁精将玻璃板清洗干净，无杂质；
（2）按照需要配制浓度合适的分离胶和适量的浓缩胶；
（3）将分离胶倒入玻璃板内，用无水乙醇液封，大约三十分钟凝固；
（4）倒掉无水乙醇并有滤纸吸干残留的无水乙醇；
（5）倒入浓缩胶，迅速将梳子插进浓缩胶内，确保浓缩胶内无气泡，大约三十分钟凝固；
（6）凝固后，用三蒸水冲洗胶板，放入电泳槽内，外槽电泳液可回收利用，内槽电泳液现用现配；
（7）上样后，浓缩胶恒压 80 V，分离胶恒压 120 V；
（8）切胶，保留目的蛋白凝胶区域，裁剪合适大小的 PVDF 膜，用无水甲醇激活，按照白板-黑泡沫棉-白棉-三层滤纸- PVDF 膜-凝胶-三层滤纸-白棉-黑泡沫棉-黑板的顺序组装，注意除去每层之间气泡，对准正负极放入转膜槽中，加入转膜液和冰盒，200 mA 冰水浴中恒流转适当时间，转膜时长根据目的蛋白分子大小调整。
（9）然后将 PVDF 膜浸泡在 5%BSA 或脱脂牛奶里室温封闭 1 小时；
（10）孵育一抗，4℃ 过夜；
（11）第二天，回收一抗，用 TBST 洗三次，每次 10 分钟；
（12）在摇床上室温孵育与一抗同种属的二抗 1 小时；
（13）用 TBST 洗 3 次，每次 10 分钟；
（14）将发光液均匀铺满 PVDF 膜上进行曝光。

1、配胶板和梳子要对应使用，区分 1.0 mm和 1.5 mm。
2、常见 RIPA 一般为 10x，需用 PBS 稀释成 1x 使用。
3、制备组织样本时，两个样本之间需用三蒸水-酒精-三蒸水的顺序清洗。
4、发光液需避光。
5、电泳槽内电泳液每次换新，槽外可回收利用。

1、确认一抗好用的前提，条带出现明显的泳道，几乎看不清条带？
答：TBST不干净，没有将膜洗干净。

2、条带出现手拉手的现象？
答：蛋白上样量太多。

3、电泳时，溴酚蓝明显歪曲？
答：电泳槽与胶之间没有夹紧，出现漏夜导致的。