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实验流程：

蛋白样品的制备(裂解细胞)——制胶——上样及电泳——转膜——分别加入一抗、酶标二抗。

具体实验步骤：

1、细胞裂解进行蛋白提取的步骤同 COIP 细胞裂解的步骤。

2、制胶：电泳的过程中需要配置分离胶和浓缩胶，每一个胶板大致配 7—8mL 的分离胶，3-4mL 的浓缩胶。（先配分离胶再配浓缩胶）。将配置好的分离胶加入到两玻璃之间，注意加入的位置，然后在其上加入 75% 的乙醇，待其自然凝固后将其中的乙醇倒掉，用水轻轻的冲洗，再将浓缩胶倒入其中让其慢慢凝固。（不要忘记插梳子，若不立即进行电泳则需要先将配置好的胶板放到冰箱中防止其变干。）

3、为了防止电泳过程中条带的弯曲，在安装电泳仪之前要用两个胶板固定使其平衡。玻璃板低的一侧朝向里面，注意电极正负，电泳之前要在电泳槽中倒入电解液（电解液使用次数最好不超过三次）

4、上样之前要进行上样量的计算，要使所有样品的上样量都保持一致，控制单一变量（总体积和上样量保持一致）。上样之前蛋白需要进行煮沸，使蛋白裂解。煮沸过之后用小的离心机稍微离心。

5、上样及电泳；先加入 Buffer,然后依次的加入样品，最后加入 2-3uL 的Marker。打开电源，调至电压至 100V，待 Marker 条带分明时（大概需要30min）,然后将电压调至 150V，至 Marker 中的红色条带跑到下面为止。

6、转膜：膜需要先用甲醛进行活化，电转液需要提前配置进行预冷。转膜之前膜和胶之间不要有空隙。电压 100v，电流不能超过 400，进行 50 或 60min 。

7、封闭完之后，加入抗体进行封膜处理，封膜1h。（注意：封膜之前要将里面的气泡赶走，以免影响抗体孵育。）

8、取出膜用 TBST 洗3次，每次 10 min。

9、加入二抗进行孵育，步骤同 7。孵育 1 h。 孵育过之后用 TBST 清洗三次。

10、暗室显影：加入和二抗结合的AB液，（主要的目的是与二抗结合发出荧光）。

1、电转液需要提前遇冷

2、孵抗体的时候要将气泡赶走

转膜的时候为什么 Marker 有时会模糊?

在进行转膜的时候一定要将电转液放在冰上进行提前遇冷，电转的过程中电流不要过高。