【浅霾】我的 WB 经验分享，快来帮我点赞吧！

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检测目的蛋白表达量

PBS，裂解液，ddH2O，30% 预制胶，Tris-HCl(pH8.8)，Tris-HCl(pH6.8)，SDS，APS，TEMED，BCA 的 A 液及 B 液，loading buffer，marker，甲醇，电泳液，转膜液，脱脂奶粉，TBST，一抗及对应二抗，显影 A 液，细胞刮刀，1.5ml 离心管，移液枪及枪头，96 孔板，离心机，电泳槽，PVDF 膜，摇床，曝光机。

一、蛋白样品制备（单层贴壁细胞）

1.倒掉培养液，PBS洗涤，弃净PBS，加入裂解液（毫升数视细胞数确定），置于冰上或4℃冰箱裂解10min，用细胞刮刀及移液枪将细胞碎片及裂解液移至1.5ml离心管，继续裂解20min。

2.于4℃离心机离心（14000rpm，15min），取上清，置于-20℃冰箱保存。

二、蛋白含量的测定（BCA）

1.取出蛋白样品，置于冰上融化。取4微升样品，20倍稀释（4微升样品+76微升ddH2O）。

2.配制BCA液（A:B=50:1），在96孔板上每孔加入100微升BCA液，加入20微升被试，每个样品重复3孔。避光37℃30min，于562nm测定，计算蛋白浓度。

三、电泳

1.玻璃板夹好，检漏后，加入 10% 分离胶。

10% 分离胶（20ml）=8ml ddH2O+6.6ml 预制胶 +5ml Tris-HCl(pH8.8)+0.2ml 10%SDS+0.2ml 10%APS+0.008ml TEMED

用移液枪加胶，加异丙醇，约30min后分离胶凝固，倒去异丙醇，加入5%浓缩胶。

5%浓缩胶（6ml）=4.05ml ddH2O+1ml30%预制胶+0.75ml Tris-HCl(pH6.8)+0.06ml 10%SDS+0.06ml 10%APS+0.006ml TEMED

插入梳子，约30min后浓缩胶凝固，放入电泳槽。

2.配制上样的样品，100℃ 金属浴 15min，放凉，上样，上 marker，60V 电泳，也可为 80V，跑过浓缩胶后可加到120V，跑至底层后可停止，也可在刚跑出时停止。

四、转膜

1.剪取适宜大小的 PVDF 膜，浸泡在无水乙醇中 2 min活化，移入转膜液中浸泡。

2.三明治结构：夹子的黑色一面+海绵垫+三层滤纸+胶+膜+三层滤纸+海绵垫+夹子的透明一面，夹紧。放入转移槽，夹子的黑色一面对槽的黑色一面，夹子的透明色一面对槽的红色一面，放入冰中，或在4℃冰箱转膜，250mA，2.5h。

3.可用丽春红染色后切膜，用 TBST 洗净。

五、封闭

1.以 TBST 作溶剂配制 5% 脱脂奶粉。

2.膜浸泡于 5% 脱脂奶粉，于摇床上低速摇晃，封闭 2 h，弃去 5% 脱脂奶粉，以TBST 于摇床上高速摇晃，洗涤 5 min，重复三次。

六、一抗孵育

1.加入一抗，于 4℃ 冰箱孵育过夜。

七、二抗孵育

1.回收一抗，TBST 洗涤 15min，重复三次。

2.加入对应的二抗，于摇床上常温孵育 2h，TBST 洗涤 15min，重复三次。

八、显影

1.将显影 A 液和 B 液以 1：1 配制，将膜浸入显影液 5s 后，即可在曝光机上曝光。

1.三明治结构不可有气泡。

2.显影液现配现用。

3.TEMED 有毒，注意防护。

4.APS 和 TEMED 是催化剂，最后加。

1.上样量多少？
我一般是 15-30 g，如果结果显示蛋白量很低，可能还会再增加。

2.裂解液的配制？
1ml 裂解液=560 微升 ddH2O+300 微升 3.3xRIPA+40 微升 25x蛋白酶抑制剂+100微升 10 x磷酸酶抑制剂+10 微升 PMSF+2 微升 DNase I

3.可用水代替异丙醇吗？
可以用水，只是异丙醇密度更大，压的效果会更好一些。